该操作步骤描述了单管碎片、末端修复和 A 加法的 FX 反应。以下操作步骤以产品货号180473的实验步骤为例

开始前的要点
· 在设置反应之前，准确确定输入 DNA 的量至关重要。

· 确保输入 DNA 在水中、10 mM Tris、QIAGEN 缓冲液 EB 或低 TE（0.1x TE，0.1 毫米乙二胺四乙酸）。如果输入 DNA 在 1x TE 中，请根据附录 B 中的操作步骤设置 FX 反应。

图 1. 不同输入 DNA 量的片段化谱。

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表 1. 选择初始碎片时间的指南

片段峰大小	250 个基点	350 碱基对	450 碱基对	550 碱基对
32°C 下的碎裂时间 (min)
50 pg –1 ng 输入 DNA*	14	4	1	–
10 ng 输入 DNA†	24	16	14	10
100 ng 输入 DNA	16	10	8	6
1000 ng 输入 DNA	14	8	6	4

注意：相同的 FX 片段化时间将在输入 DNA 量的大约 5 倍范围内产生一致的片段大小。可能需要针对不同质量的 DNA 样本优化确切的反应时间。
*对于 20 到 50 pg 之间的输入 DNA 量，将包括 FX 增强剂在内的 FX 反应孵育 25 分钟，以产生以 250 bp 为中心的片段分布。
对于 <10 ng 的输入 DNA，需要 FX Enhancer 以获得最佳性能（表 4）.要从 1 ng 输入产生以 300 bp 为中心的片段分布，请将包括 FX Enhancer 在内的 FX 反应孵育 10 分钟。

开始前要做的事情
· 参考图1和表格1以确定将输入 DNA 片段化为所需大小所需的时间。如果输入 DNA 小于 10 ng，请根据操作步骤添加 FX Enhancer，并使用 10 ng 输入 DNA 所列反应时间的一半。例如，要从 1 ng 输入产生以 300 bp 为中心的片段分布，请将包括 FX Enhancer 在内的 FX 反应孵育 10 分钟。

· 制作新鲜的 80% 乙醇。

· 在冰上解冻试剂。一旦试剂解冻，通过快速涡旋彻底混合缓冲液以避免任何局部浓度。使用前短暂旋转涡旋试剂。

· 程序热循环仪。为了提高速度和便利性，操作步骤的所有孵化步骤都可以预先编程和保存。

程序
1.  根据表 2 使用步骤 2 的预定 FX 碎裂时间对热循环仪进行编程。确保使用仪器的加热盖，如果可能，将加热盖的温度设置为 70°C。

 

表 2. 不含 EDTA、缓冲液 EB 或 0.1x TE 的输入 DNA (20 pg –1000 ng)

步	孵化温度	孵化时间
1	4°C	1分钟
2	32°C	1–30 分钟*
3	65°C	30分钟
4	4°C	抓住

*要确定步骤 2 的反应时间，请参阅图1和表格1。

2.  启动程序。当热循环仪模块达到 4°C 时，暂停程序。

3.  根据在冰上的 PCR 板或试管中制备 FX 反应混合物表3对于 >10 ng 输入 DNA 或表 4<10 ng 输入 DNA。轻轻吹打混匀（不要涡旋混匀）。

表 3. >10 ng 输入 DNA 的 FX 反应混合物设置（每个样品）

组分	体积（微升）
纯化 DNA	变量
FX 缓冲液，10x	5
无核酸酶水	变量
不含 FX 酶混合物	10
总计	40

 

表 4. <10 ng 输入 DNA 的 FX 反应混合物设置（每个样品）

组分	体积（微升）
FX 缓冲液，10x	5
纯化 DNA	变量
FX 增强剂	2.5
无核酸酶水	多变的
不含 FX 酶混合物	10
总计	40

4.  在每个反应中加入 10 µl FX Enzyme Mix，并通过上下吹打 20 次充分混合。在反应设置期间，将反应始终保持在冰上至关重要。

5.  短暂旋转 PCR 板/管并立即转移到预冷的热循环仪 (4°C)。恢复骑行程序。

6.  当热循环仪程序完成并且样品块恢复到 4°C 时，取出样品并将它们放在冰上。

7.  立即按照下一个操作步骤中的说明进行适配器连接。

开始前要做的事情
· 使用前将 Agencourt AMPure XP 微珠平衡至室温 (15–25°C) 20–30 分钟。

· 使用前涡旋并向下旋转解冻的适配器板。

程序
1.  取下保护性适配器板盖，刺穿要使用的每个适配器孔的箔密封，然后将 5 µl 从一个 DNA 适配器孔转移到前一个方案中的每个 50 µl 样品中。跟踪用于每个样品的每个适配器的条形码。
    注意：如果您的 DNA 输入量 <10 ng，请根据表 5。

表 5. 适配器稀释因子

样本 DNA 量	适配器稀释
20–99 皮	1:1000
100–999 皮克	1:100
1–9 纳克	1:10

2.  更换适配器板盖并冷冻未使用的适配器。转接板在至少 10 次冻融循环中是稳定的。
    重要提示：每个连接反应只能使用 1 个单一接头。如果使用其他供应商的适配器，请遵循制造商的说明。一旦箔密封被刺穿，请勿重复使用适配器孔。

3.  准备连接预混液（每个 DNA 样本，表 6) 在单独的 PCR 板或冰管中，并通过移液器充分混合。

表 6. 连接预混液设置（每个样品）

零件	体积（微升）
连接缓冲液，5x	20
DNA连接酶	10
无核酸酶水	15
全部的	45

4.  向每个样品中加入 45 µl 的连接 Master Mix，总共 100 µl，并通过移液器充分混合。将连接反应在 20°C 下孵育 15 分钟。
    重要提示：请勿使用带加热盖的热循环仪。

5.  立即使用 0.8x (80 µl) Agencourt AMPure XP 珠子进行接头连接清理。

6.  将 80 µl 重悬的 Agencourt AMPure XP 微珠添加到每个连接的样品中，并通过移液器充分混合。

7.  在室温下孵育混合物 5 分钟。将磁珠放在磁性支架（例如 DynaMag）上 2 分钟，然后小心丢弃上清液。

8.  加入 200 µl 80% 乙醇清洗磁珠。将磁珠放在磁力架上，弃去上清液。重复洗涤一次，共 2 次乙醇洗涤。尽可能多地去除多余的乙醇。

9.  在磁力架上孵育珠子 5-10 分钟或直到珠子干燥。磁珠过度干燥可能导致 DNA 回收率降低。从磁性支架上取下。

10.  通过重悬于 52.5 µl Buffer EB 或 10 mM Tris·Cl，pH 8.0 中进行洗脱。将磁珠放在磁力架上。小心地将 50 µl 上清液转移到新的板或管中。

11.  按照步骤 7–9 进行 DNA 结合和洗涤，使用 1x (50 µl) Agencourt AMPure XP 微珠进行第二次纯化。加入 26 µl Buffer EB 或 10 mM Tris·Cl，pH 8.0 洗脱 DNA。使磁珠成团并在 DNA LoBind 管中小心收集 23.5 µl 纯化的 DNA 样本，用于文库扩增。如果不立即进行，样品可以储存在 -30 至 -15°C。

如果输入 DNA 量低于 100 ng 或下游杂交捕获需要大量文库，通常需要基于 PCR 的文库扩增。该方案用于使用 QIAseq FX DNA Library Kit 中提供的扩增试剂对 DNA 文库进行高保真扩增。

开始前要做的事情
· 在冰上解冻 QIAseq HiFi PCR Master Mix 和 Primer Mix。一旦试剂解冻，通过快速涡旋将它们彻底混合，以避免任何局部浓度。

· 始终从本操作步骤中指定的循环条件开始。循环已经过优化，可与 QIAseq HiFi PCR Master Mix 一起使用，以实现测序文库的均匀和高保真扩增。

程序
1.  根据表 7。

 

表 7. 文库扩增循环条件

时间	温度	循环次数
2 分钟	98°C	1
20 s	98°C
30 s	60°C	6（100 ng 输入 DNA）
		10（10 ng 输入 DNA）
		12（1 ng 输入 DNA）
		14（100 pg 输入 DNA）
		16（20 pg 输入 DNA）
30 s	72°C
1分钟	72°C	1
∞	4°C	抓住

注意：根据输入 DNA 的数量和质量，建议进行 6-16 个扩增循环。

2.  根据以下方法在冰上制备反应混合物表 8。在 PCR 管或 96 孔 PCR 板中混合成分。

表 8. 文库富集的反应混合物

零件	体积（微升）
高保真 PCR 预混液，2x	25
底漆混合物（每个 10 µM）	1.5
图书馆 DNA	23.5
总反应体积	50

3.  将 PCR 管或板转移到热循环仪并启动程序。

4.  PCR 完成后，将 50 µl 重悬的 Agencourt AMPure XP Beads 添加到每个反应 (50 µl) 中，并上下吸管彻底混合。

5.  在室温下孵育混合物 5 分钟。将磁珠放在磁性支架（例如 DynaMag）上，小心丢弃上清液。

6.  加入 200 µl 80% 乙醇清洗磁珠。将磁珠放在磁力架上，弃去上清液。重复洗涤一次，共 2 次乙醇洗涤。尽可能多地去除多余的乙醇。

7.  在磁力架上孵育 5-10 分钟或直到珠子变干。磁珠过度干燥可能导致 DNA 回收率降低。从磁性支架上取下。

8.  通过重悬于 25 µl Buffer EB 或 10 mM Tris·Cl，pH 8.0 中进行洗脱。将磁珠放在磁力架上。小心地将 23 µl 上清液转移到新试管中。

9.  使用 QIAGEN QIAxcel 或 Agilent BioAnalyzer 等毛细管电泳设备评估文库的质量。检查预期的尺寸分布（见图 2)库片段和没有接头或接头二聚体的峰值约为 120 bp。
    注意：文库应显示以片段 DNA 大小加 120 bp 为中心的分布（参见图 2).文库长度的增加反映了向 DNA 片段添加了测序接头。中值片段大小可用于后续基于 qPCR 的量化方法来计算库浓度（步骤 10）。

10.  使用基于 qPCR 的方法量化库，例如 QIAseq Library Quant Assay Kit（货号 333314；未提供）或类似方法。

11.  纯化的文库可以安全地储存在 -30 至 -15°C 的 DNA LoBind 管中，直到准备好用于测序或其他应用。

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