开始前的要点

· 该方案经过优化，可富集源自所有具有 poly-A 尾的真核物种的 RNA。

· 推荐的总 RNA 输入量为 100 ng – 1 µg。

·200 µl 板中的 mRNA 富集” 用于使用 200 µl 试管或 96 孔板富集 mRNA。可参看附录（附录的内容可从QIAGEN官网下载货号为180773的产品全部说明书进行了解）。

开始前要做的事情

· 所有缓冲液和试剂在使用前都应涡旋以确保充分混合。

· 在第一次使用前涡旋 Pure mRNA Beads 3 分钟或在后续使用前涡旋 1 分钟。

· 将水浴或加热块加热至 70°C，并将缓冲液 OEB 加热至 70°C。

· 除非另有说明，否则所有操作步骤步骤（包括离心）均应在室温下进行。

程序：在 1.5 ml 管中富集 mRNA
1.  涡旋 Pure mRNA Beads 1 分钟以彻底重悬。

2.  根据准备富集反应表 2。短暂离心、涡旋并再次短暂离心。

表 2. 富集反应设置

零件	体积/反应
总 RNA (100 ng – 1 µg)	可变
RNase 抑制剂	1 µl
缓冲 mRBB	250µl
彻底重悬的 Pure mRNA Beads	25µl
无核酸酶水	使总反应体积达到 526 µl
总容积	526 µl

3.  在 70°C 下孵育 3 分钟，然后在室温下孵育 10 分钟。

4.  短暂离心，然后将试管放在磁性架上。溶液清除后（约 2 分钟），弃去上清液。

5.  添加 400 µl 缓冲液 OW2。涡旋，短暂离心，然后将试管放在磁性架上。溶液澄清后，弃去上清液。

6.  重复步骤 5。

7.  添加 50 µl 缓冲液 OEB。涡旋，短暂离心，并在 70°C 下孵育 3 分钟。

8.  将样品从 70°C 中取出并在室温下放置 5 分钟。

9.  添加 50 µl Buffer mRBB 并涡旋。短暂离心，室温孵育 10 分钟。

10.  短暂离心，然后将试管放在磁性架上。溶液澄清后，小心弃去上清液。将任何残留液体留在管中，以尽量减少珠粒损失

。
11.  添加 400 µl 缓冲液 OW2。涡旋，短暂离心，并将试管放在磁性架上。溶液澄清后，弃去上清液。

12.  将 29 µl 加热至 70°C 的 Buffer OEB 添加到珠粒中，然后涡旋。

13.  短暂离心，将管子放在磁性架子上。溶液澄清后，将 27 µl 上清液转移到干净的试管中。上清液含有富集的 poly(A)+ RNA。

14.  继续 ”方案：片段化/FastSelect RNA 去除”。或者，样品可以储存在 –90 至 –65°C。

开始前的要点

· 整个 27 µl 产品来自“操作步骤：mRNA 富集”是片段化/FastSelect RNA 去除的起始材料。

· FastSelect 去除珠蛋白 mRNA（单独出售，参见“订购信息”) 建议在从全血样本中富集 mRNA 时使用。

· 为了生成最佳插入大小，需要根据 RNA 的质量和来源确定每个实验的片段化时间。遵循中的建议表 4。

程序
1.  在冰上解冻先前富集的 mRNA。轻轻混合，然后短暂离心以收集管壁上的残留液体，然后放回冰上。

2.  准备 RNA 片段化和 QIAseq FastSelect 珠蛋白 mRNA 去除所需的试剂。
    2a.在室温下从适当的 QIAseq FastSelect RNA Removal Kits 中解冻 RT Buffer、5x、Nuclease-Free Water 和试管。
    2b.通过涡旋混合，然后短暂离心以收集管侧面的残留液体。

3.  在冰上，根据表3。短暂离心，上下吹打混合 10 次，然后再次短暂离心。
    注意：如果设置多个反应，则准备的主混合物体积比反应总数所需的量大 10%。

表 3. 片段化/RNA 去除反应的设置

零件	体积/反应
mRNA 富集反应（已在试管中）	27µl
RT 缓冲液，5x	8µl
QIAseqFastSelect–Globin*	1 µl
ERCC控制†	可选的
无核酸酶水	1µl
总容积	37 µl

*来自 QIAseq FastSelect RNA 去除试剂盒。如果没有执行，请添加 1 µl 无核酸酶水。

4.  如中所述孵育表 4，根据您输入的 RNA 质量和插入片段的大致大小。

表 4. 片段化/RNA 去除方案

输入 RNA 质量	步	插入大小 ~150–250 bp	插入大小 ~350 bp
高品质 (RIN >9)	1*	95°C 15 分钟	95°C 下 3 分钟
中等质量 (RIN 5–6)	1*	95°C 10 分钟	95°C 下 3 分钟
FFPE 或降解样品 (RIN <3)	1*	无碎片†	无碎片†
重要提示：如果执行 FastSelect Globin mRNA Removal，则仅包括步骤 2-9 使用 FastSelect –Globin 时执行步骤 2-9，无论输入 RNA 质量如何。无论 RNA 是否高质量，都需要执行它们，中等质量、FFPE 或退化。	2	75°C 下 2 分钟	75°C 下 2 分钟
	3	70°C 下 2 分钟	70°C 下 2 分钟
	4	65°C 下 2 分钟	65°C 下 2 分钟
	5	60°C 下 2 分钟	60°C 下 2 分钟
	6	55°C 下 2 分钟	55°C 下 2 分钟
	7	37°C 下 2 分钟	37°C 下 2 分钟
	8	2 分钟，25°C	2 分钟，25°C
	9	保持在 4°C	保持在 4°C

*根据输入的 RNA 质量和所需的插入大小，为第 1 步选择一个选项。
也适用于大小在 80-500 bp 之间的外泌体 RNA 或其他来源的 RNA。

5.  立即进行“操作步骤：第一链合成”.

开始前的要点

· 整个 37 µl 产品来自“方案：片段化/FastSelect RNA 去除”是第一链合成的起始材料。

· 在冰上建立第一链合成。

· 不要涡旋任何第一链合成试剂或反应。

· 使用带加热盖的热循环仪。

· 确保 QIAseq Beads 在使用前达到室温。

· 确保 QIAseq Beads 始终完全混合。这需要快速工作并在使用前立即重新悬浮珠子。如果操作步骤出现延迟，只需涡旋磁珠即可。

程序
1.  准备第一链合成所需的试剂。

    1a.在室温下解冻 1 M DTT。
    1b.轻弹试管混合。
    1c.离心机从管的侧面收集残留的液体。
    注意：RT Enzyme 和 RNase Inhibitor 应在使用前从冰箱中取出并置于冰上。使用后，立即将酶放回冰箱。

2.  将 1 M DTT 稀释至 0.4 M 用于表 5。

3.  在冰上，根据表 5。短暂离心，上下吹打混合 10 次，然后再次短暂离心。
    注意：如果设置多个反应，则准备的主混合物体积比反应总数所需的量大 10%。

表 5. 第一链反应的设置

零件	体积/反应
片段化/RNA去除反应（已在试管中）	37µl
稀释 DTT (0.4 M)	1µl
逆转录酶	1µl
核糖核酸酶抑制剂	1µl
总容积	40 µl

4.  如中所述孵育表 6。

表 6. 第一链操作步骤

步	温度	孵化时间
1	25 °C	10 分钟
2	42°C	15 分钟
3	70°C	15 分钟
4	4°C	抓住

5.  加入 56 µl 重悬的 QIAseq Beads。涡旋 3 s 并短暂离心。

6.  在室温下孵育 5 分钟。

7.  将管/板放在磁性架上。溶液清除后（约 10 分钟或更长时间），小心取出并丢弃上清液。
    重要提示：不要丢弃磁珠，因为它们含有感兴趣的 DNA。

8.  试管仍在磁力架上，加入 200 µl 80% 乙醇。旋转管/板 3 次以清洗珠子。小心取出并丢弃洗涤液。

9.  重复乙醇洗涤。
    重要提示：第​​二次洗涤后，彻底清除所有乙醇痕迹。短暂离心并将试管放回磁力架。先用 200 µl 移液器除去乙醇，然后用 10 µl 移液器除去任何残留的乙醇。

10.  管/板（盖打开）仍然在磁性支架上，在室温下风干 5-10 分钟。
    注意：目视检查颗粒是否完全干燥并且所有残留的乙醇都已蒸发。

11.  从磁性支架上取下管/板。加入 40 µl Nuclease-Free Water 从磁珠中洗脱 DNA。通过移液充分混合。

12.  将管/板放回磁架，直到溶液清除。

13.  转移 38.5 µl 上清液至清洁管/板。

14.  继续 ”方案：第二链合成、末端修复和 A 加成”。或者，可以将样品储存在 –30 至 –15°C 的恒温冰箱中。

开始前的要点

· 整个 38.5 µl 产品来自“操作步骤：第一链合成”是第二链合成、末端修复和A-加成过程的起始材料。

· 在冰上建立反应。

· 不要涡旋任何第二链合成、末端修复和 A 加成试剂或反应。

· 使用带加热盖的热循环仪。

· 确保 QIAseq Beads 在使用前达到室温。

· 确保 QIAseq Beads 始终充分混合。这需要快速工作并在使用前立即重新悬浮珠子。如果操作步骤出现延迟，只需涡旋磁珠即可。

程序
1.  准备所需的试剂。
    1a.在室温下解冻第二股缓冲液，10x。

    1b.通过涡旋混合。
    1c.离心机从管的侧面收集残留的液体。
    注意：Second Strand Enzyme Mix 应在使用前从冰箱中取出并置于冰上。使用后，立即将酶放回冰箱。

2.  在冰上，根据表 7。短暂离心，上下吹打混合 10 次，然后再次短暂离心。
    注意：如果设置多个反应，则准备的主混合物体积比反应总数所需的量大 10%。

零件	体积/反应
产品来自“操作步骤：第一链合成”	38.5µl
第二链缓冲液，10x	5µl
第二链酶混合物	6.5µl
总容积	50µl

表 7. 第二链合成、末端修复和 A 加成反应的设置

3.  如中所述孵育表 8。

表 8. 第二链合成、末端修复和 A 加成方案

步	温度	孵化时间
1	25 °C	30分钟
2	65°C	15 分钟
3	4°C	抓住

4.  添加 70 µl 重悬的 QIAseq Beads。涡旋 3 s 并短暂离心。

5.  在室温下孵育 5 分钟。

6.  将管/板放在磁性架上。溶液清除后（约 10 分钟或更长时间），小心取出并丢弃上清液。
    重要提示：不要丢弃磁珠，因为它们含有感兴趣的 DNA。

7.  试管仍在磁力架上，加入 200 µl 80% 乙醇。旋转管/板 3 次以清洗珠子。小心取出并丢弃洗涤液。

8.  重复乙醇洗涤。
    重要提示：第​​二次洗涤后，彻底清除所有乙醇痕迹。短暂离心并将试管放回磁力架。先用 200 µl 移液器除去乙醇，然后用 10 µl 移液器除去任何残留的乙醇。

9.  管/板（盖打开）仍然在磁性支架上，在室温下风干 5-10 分钟。
    注意：目视检查颗粒是否完全干燥并且所有乙醇都已蒸发。

10.  从磁力架上取下试管/板，加入 52 µl Nuclease-Free Water 从磁珠中洗脱 DNA。通过移液充分混合。

11.  将管/板放回磁架，直到溶液清除。

12.  转移 50 µl 上清液至清洁管/板。

13.  继续 ”操作步骤：链特异性连接”。或者，可以将样品储存在 –30 至 –15°C 的恒温冰箱中。

开始前的要点

· 整个 50 µl 产品来自“方案：第二链合成、末端修复和 A 加成”是链特异性连接的起始材料。

· 在冰上建立反应。

· 不要涡旋任何链特异性连接酶或反应。

· 使用没有加热盖的热循环仪。

· 对于 UDI 转接板，24-plex 和 96-plex 板的布局在“附录 答：QIAseq 双指数 Y 型适配器”。 QIAseq Unique Dual-Index Kits 中使用的索引基序列于www.qiagen.com。

· 对于 CDI 转接板，布局和条形码序列在附录 A 中进行了描述。

· 未使用、未稀释的适配器可储存在 –30 至 –15°C。如果需要，可以在板储存前取出并丢弃残留的稀释适配器。
  重要提示：请勿重复使用稀释的适配器，因为存在条形码交叉污染的风险稀释材料储存后接头浓度低于预期。

· 确保 QIAseq Beads 在使用前达到室温。

· 确保 QIAseq Beads 始终充分混合。这需要快速工作并在使用前立即重新悬浮珠子。如果操作步骤出现延迟，只需涡旋磁珠即可。

程序
1.  准备所需的试剂。
    1a.在室温下解冻 Ultralow Input Ligation Buffer、4x 和 Ligation Initiator。

    1b.通过涡旋混合。
    1c.离心机从管的侧面收集残留的液体。
    注意：超低输入连接酶应在使用前从冰箱中取出并放在冰上。使用后，立即将酶放回冰箱。

2.  如下准备转接板。 24-plex 和 96-plex 一次性转接板的布局显示在附录 A 中。
    注意：如果多路复用 1-6 个样本，请参阅 Illumina 的富集操作步骤的 Low-Plex Pooling Guidelines 文档以选择理想的适配器组合。
    2a.在室温下解冻转接板。使用前短暂涡旋和离心。
    2b.取下透明的保护适配器板盖，小心地仅刺穿每个要使用的适配器孔的箔密封，使用新的尖端刺穿每个孔。
    2c.按照中的建议取出等分试样并稀释接头表 9。

表 9. QIAseq 接头的稀释

总 RNA 输入量	适配器稀释
100 纳克	1:100
500 纳克	1:25
1µg	1:12.5
5µg	1:5

    2d.更换板盖并将未使用的、未稀释的适配器冷冻在 –30 至 –15°C。在板储存前取出并丢弃残留的稀释适配器。

3.  在冰上，根据表 10。短暂离心。上下吹打 15-20 次混合并再次短暂离心。
    注意：如果设置多个反应，则准备的主混合物体积比反应总数所需的量大 10%。
    重要提示：移液器缓慢混合。连接引发剂和反应混合物非常粘稠。

表 10. 链特异性连接反应的设置

零件	体积/反应
产品来自“方案：第二链合成、末端修复和 A 加成”	50µl
稀释适配器*	2µl
超低输入连接缓冲液，4x	25µl
超低输入连接酶	5µl
连接引发剂	6.5µl
无核酸酶水	11.5µl
总容积	100µl

*为每个样品选择一个独特的适配器。

4.  在 25°C 下孵育 10 分钟。
    重要提示：请勿使用加热的盖子。

5.  添加 80 µl 重悬的 QIAseq Beads。涡旋 3 s 并短暂离心。

6.  在室温下孵育 5 分钟。

7.  将管/板放在磁性架上。溶液清除后（约 10 分钟或更长时间），小心取出并丢弃上清液。
    重要提示：不要丢弃磁珠，因为它们含有感兴趣的 DNA。

8.  试管仍在磁力架上，加入 200 µl 80% 乙醇。旋转管/板 3 次以清洗珠子。小心取出并丢弃洗涤液。

9.  重复乙醇洗涤。
    重要提示：第​​二次洗涤后，彻底清除所有乙醇痕迹。短暂离心并将试管放回磁力架。先用 200 µl 移液器除去乙醇，然后用 10 µl 移液器除去任何残留的乙醇。

10.  管/板（盖打开）仍然在磁性支架上，在室温下风干 5-10 分钟。
    注意：目视检查颗粒是否完全干燥并且所有乙醇都已蒸发。

11.  从磁力架上取下试管，加入 92 µl Nuclease-Free Water 从磁珠中洗脱 DNA。通过移液充分混合。

12.  将管/板放回磁架，直到溶液清除。

13.  将 90 µl 上清液转移到清洁的管/板中。

14.  添加 108 µl 重悬的 QIAseq Beads。涡旋 3 s 并短暂离心。

15.  在室温下孵育 5 分钟。

16.  将管/板放在磁性架上。溶液清除后（约 10 分钟或更长时间），小心取出并丢弃上清液。
    重要提示：不要丢弃磁珠，因为它们含有感兴趣的 DNA。

17.  试管仍在磁力架上，加入 200 µl 80% 乙醇。旋转管/板 3 次以清洗珠子。小心取出并丢弃洗涤液。

18.  重复乙醇洗涤。
    重要提示：第​​二次洗涤后，彻底清除所有乙醇痕迹。短暂离心并将试管放回磁力架。先用 200 µl 移液器除去乙醇，然后用 10 µl 移液器除去任何残留的乙醇。

19.  管/板（盖打开）仍然在磁性支架上，在室温下风干 5-10 分钟。
    注意：目视检查颗粒是否完全干燥并且所有乙醇都已蒸发。

20.  从磁力架上取下试管/板，加入 25 µl Nuclease-Free Water，从磁珠上洗脱 DNA。通过移液充分混合。

21.  将管/板放回磁架，直到溶液清除。

22.  将 23.5 µl 上清液转移到干净的试管/板上。

23.  继续 ”操作步骤：CleanStart 文库扩增”。或者，样品可以储存在 -30 至 –15°C 的恒温冰箱中

开始前的要点

· 整个 23.5 µl 产品来自“操作步骤：链特异性连接”是 CleanStart Library Amplification 的起始材料。

· QIAseq CleanStart PCR 试剂使用专有的 PCR 反应，结合修饰酶，确保去除之前构建的 NGS 文库。重要：如果需要重新扩增之前扩增的 CleanStart 文库 - 例如，当需要额外的文库来替换失败的 NGS 运行时 - 省略 PCR 协​​议的净化步骤（在 37°C 下孵育 15 分钟）以禁用选择性降解。

· 在冰上建立反应。

· 不要涡旋任何 CleanStart 文库扩增试剂或反应。

· 使用带加热盖的热循环仪。

· 确保 QIAseq Beads 在使用前达到室温。

· 确保 QIAseq Beads 始终充分混合。这需要快速工作并在使用前立即重新悬浮珠子。如果操作步骤出现延迟，只需涡旋磁珠即可。

程序
1.  准备 CleanStart 文库扩增所需的试剂。
    1a.在室温下解冻 CleanStart PCR Primer Mix，然后在冰上解冻 2x CleanStart PCR Mix。
    1b.轻弹试管混合。
    1c.离心机从管的侧面收集残留的液体。

2.  在冰上，根据表 11。短暂离心，上下吹打混合 10 次，然后再次短暂离心。
    注意：如果设置多个反应，制备的预混液体积比反应总数所需的量大 10%。

表 11. 文库扩增设置

零件	体积/反应
产品来自“操作步骤：链特异性连接”	23.5 µl
CleanStart PCR 混合液，2x	25µl
CleanStart PCR 引物混合物	1.5µl
总容积	50µl

3.  根据总 RNA 输入选择 PCR 循环数，根据表 12。
    重要提示：使用 QIAseq FastSelect –Globin Kit 去除珠蛋白 mRNA 时，需要进行 2 个额外的文库扩增循环。

表 12. 基于总 RNA 输入的推荐 PCR 循环数

总 RNA 输入	扩增循环数*
100 纳克	14–16†
500 纳克	11–13†
1 µg	9–11†
5 µg	7–9†

*使用表 13 中选定的扩增循环数。
重要提示：当使用 QIAseq FastSelect -Globin RNA Removal 去除珠蛋白 mRNA 时，需要进行 2 个额外的文库扩增循环。

4.  如中所述孵育表 13。

表 13. CleanStart 文库扩增循环条件

步	时间	温度	循环次数
CleanStart 去污*	15 分钟	37°C	1
初始变性	2 分钟	98°C	1
聚合酶链反应	20 s	98°C	看表 12
	30 s	60°C
	30 s	72°C
最终延期	1分钟	72°C	1
抓住	∞	4°C	抓住

*对于文库的重新扩增，省略 CleanStart 去污步骤并开始在 98°C 下孵育 2 分钟。

5.  扩增后，加入 60 µl QIAseq Beads。涡旋 3 s 并短暂离心。

6.  在室温下孵育 5 分钟。

7.  将管/板放在磁性架上。溶液清除后（约 10 分钟或更长时间），小心取出并丢弃上清液。
    重要提示：不要丢弃磁珠，因为它们含有感兴趣的 DNA。

8.  将管/板仍在磁力架上，加入 200 µl 80% 乙醇。旋转管子 3 次以清洗珠子。小心取出并丢弃洗涤液。

9.  重复乙醇洗涤。
    重要提示：第​​二次洗涤后，彻底清除所有乙醇痕迹。短暂离心，然后将试管放回磁力架。先用 200 µl 移液器除去乙醇，然后用 10 µl 移液器除去任何残留的乙醇。

10.  管/板（盖打开）仍然在磁性支架上，在室温下风干 5-10 分钟。
    注意：目视检查颗粒是否完全干燥并且所有乙醇都已蒸发。

11.  从磁力架上取下试管/板，加入 22 µl Nuclease-Free Water 从磁珠上洗脱 DNA。通过移液充分混合。

12.  将管/板放回磁架，直到溶液清除。

13.  转移 20 µl 以清洁试管/板。这是 QIAseq 链式测序文库。

14.  继续 ”建议：文库 QC、定量和测序”。或者，可以将样品储存在 –30 至 –15°C 的恒温冰箱中。

NGS 文库质控
QC 可以使用安捷伦生物分析仪或 TapeStation 进行。检查库片段的大小分布是否正确（中值大小约为 300–500 bp）以及是否缺少适配器或适配器二聚体（~130 bp）。图 3显示了从 UHRR 输入材料制备的 1 ng 和 50 ng 文库的文库大小分布。两个结果都没有显示适配器二聚体的痕迹。 1 ng 输入 RNAseq 文库显示最佳大小分布，而 50 ng 输入 RNAseq 文库显示更广泛的文库大小分布（但不影响 NGS 测序质量）。

图 3. QIAseq Stranded RNAseq 文库大小分布，使用安捷伦生物分析仪高灵敏度 DNA 芯片在标准方案条件和不同输入量下测量。左：1 ng，右：50 ng UHRR 输入材料。

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重要提示：如果在文库 QC 后出现过多的接头二聚体 (~130 bp)（超过文库总产量的 1-2%），请使用 QIAseq 珠进行第二次纯化。这可以通过使样品达到 55 µl 的最终体积并重复步骤来完成5–13 CleanStart 文库扩增。

首选文库量化方法
Bioanalyzer 或 TapeStation 的文库产量测量依赖于嵌入 DNA 或 RNA 的荧光染料。这些染料无法区分带有或不带有接头序列的 cDNA，因此只能对具有完整接头序列的完整 QIAseq Stranded mRNA Select 文库进行测序。因此，强烈建议使用 QIAGEN 的 QIAseq Library Quant Array Kit 或 Assay Kit，其中包含经过实验室验证的正向和反向引物以及 DNA 标准品，用于对制备的 QIAseq Stranded mRNA Select 文库进行准确定量。

样品稀释、汇集、测序和数据分析
使用 QIAseq Library Quant Array 或 Assay Kit 对 QIAseq Stranded 文库进行定量后，典型的 QIAseq Stranded 文库产量在 20 µl 体积中约为 8–10 nM，具体取决于所使用的输入起始 RNA 的质量。该产量足以进行 NGS 测序运行。将单个 QIAseq 链库稀释至 4 nM 的浓度。然后，以等摩尔量将具有不同样本索引的库组合起来。加载到 MiSeq®上的混合 QIAseq 链库的推荐起始浓度为 9 pM，而在 NextSeq 上为 1.6 pM。

mRNA 富集样本的推荐起点是 25 M 读数/样本。使用 UDI 时，需要 74 bp 双末端读取和双 10 bp 索引读取。使用 CDI 时，需要 76 bp 双末端读取和双 8 bp 索引读取。对于稀有/新型转录本、剪接位点异构体，建议使用更长的双末端读取（UDI 文库：149 bp 双末端读取和双 10 bp 索引读取，以及 CDI 文库：151 bp 双末端读取和双 8 bp 索引读取）和融合基因检测。