开始前的要点

· 重要提示：请勿使用经 DEPC 处理的水。使用高质量、无核酸酶的水。

· QIASEQ靶向RNA第一链合成组分与Ambion公司的无DNA试剂盒中的化学物质不相容。如果您的RNA样本已经过无DNA试剂处理，请联系QIAGEN技术服务部。

· 重要提示：不要忽略基因组 DNA 消除步骤。

程序

1.  解冻 QIAseq Targeted RNA First Strand Synthesis Components 试剂。短暂离心（10-15 秒）以将内容物带到试管底部。

2.  根据表6制备为每个 RNA 样本的基因组 DNA 消除混合物。 通过上下吹打轻轻混合，然后短暂离心。

表 6. 基因组 DNA 消除混合物

零件	每个样品 (µl)
核糖核酸	× (400 纳克*)
缓冲 GE	2
无核糖核酸酶水	8–x
总容积	10

标准操作步骤的默认量为 400 ng。 RNA 量范围为 25 ng – 5 µg。建议对低输入或 FFPE 样本进行修改（附录 A，第31)，附录可在QIAGEN官网下载货号为333002的完整说明书查看。

3.  将基因组 DNA 消除混合物在 42°C 下孵育 5 分钟，然后立即置于冰上至少 1 分钟。

4.  根据表7制备逆转录混合物。

表 7. 逆转录混合物

零件	每个样品 (µl)	每 n 个样本 (µl)
5x 缓冲器 BC3	4	4.4 x n
控制 P2	1	1.1 x n
RE3 逆转录酶混合物	2	2.2 x n
无核糖核酸酶水	3	3.3 x n
总容积	10	11 x n

5.  在每个含有 10 µl 基因组 DNA 消除混合物的试管中加入 10 µl 逆转录混合物。通过上下吹打轻轻混合。

6.  在 42°C 孵育恰好 15 分钟，然后在 95°C 孵育 5 分钟立即停止反应。

7.  将反应放在冰上并继续执行下一个操作步骤。
    注意：如果您希望在开始下一个方案之前存储反应，请将它们转移到-15 至 -30°C 冰箱。

1. 根据表8在PCR板条或96孔PCR板中为每个样品制备BC分配反应混合物。通过上下移液管轻轻混合。

表 8. 为每个样品准备 BC 分配反应混合物

零件	每个样品 (µl)
QIAseq RNA 5x 缓冲液	2
BC Primer Mix（每种 100 nM）	2
HotStarTaq DNA 聚合酶（6 U/µl）	0.4
无 DNase 水	4.6
cDNA	1*
总容积	10

标准方案的默认量为 1 µl。建议对低输入或 FFPE 样本进行修改（附录 A，第31)，附录可在QIAGEN官网下载货号为333002的完整说明书查看。

2.  用盖子或薄膜密封加样孔。将板条或板放入热循环仪中，并根据表9设置反应参数。

表 9. 热循环仪程序

循环次数	温度 (°C)	时间
1	95	15 分钟
1	55	15 分钟
1	65	15 分钟
1	72	7 分钟
1	4	∞

3.  程序完成后，将反应置于冰上并继续执行下一个操作步骤。
    注意：如果要在下一个操作之前储存样品，请将它们转移到 -15 至 -30°C 的冰箱中。

标准操作步骤的默认金额如下所示。建议对低输入或 FFPE 样本进行修改
将Qiaseq珠子置于室温下30分钟，并在使用前充分混合。

1.  在 10 µl 反应混合物中加入 40 µl 水，使总体积达到 50 µl，然后转移到 1.5 ml DNA LoBind 管或 96 孔 PCR 板中进行纯化。

2.  将 65 µl（1.3 倍体积）QIAseq Beads 添加到 50 µl 反应混合物中。通过上下吹打至少 10 次充分混合。

3.  在室温下孵育 5 分钟。

4.  将试管或 96 孔 PCR 板放在磁架上，以将珠子与上清液分离。溶液澄清后（约 2 分钟），小心取出并丢弃上清液。小心不要干扰珠子，因为它们含有DNA靶标。

5.  快速旋转试管或轻敲板以将任何残留液体沉淀到底​​部，然后完全去除残留的上清液。

6.  将 DNA 靶珠洗脱到 26 µl 无菌水中。通过移液充分混合。将管或板放在磁架上，直到溶液澄清。

7.  将 25 µl 上清液转移到干净的 DNA LoBind 管或新的 96 孔 PCR 板中，然后进行第二轮纯化。

8.  将 32.5 µl（1.3 倍体积）QIAseq Beads 添加到 25 µl 上清液中。通过上下吹打至少 10 次充分混合。

9.  在室温下孵育 5 分钟。

10.  将试管或 PCR 板放在磁架上，以将珠子与上清液分离。溶液澄清后（约 2 分钟），小心取出并丢弃上清液。小心不要打扰珠子，因为它们包含 DNA 目标。

11.  快速旋转试管或轻敲板以将任何残留液体沉淀到底​​部，然后完全去除残留的上清液。

12.  将 200 µl 新鲜制成的 80% 乙醇添加到试管或孔中，同时放在磁性架上。旋转管子或在磁铁的 2 个位置之间左右移动板以清洗磁珠，然后小心地取出并丢弃上清液。

13.  重复步骤12 再一次。

14.  短暂旋转管或板，或轻轻（避免飞溅）将板轻敲在桌面上，以将任何残留液体沉淀到孔的底部（目视确认这一点）。放在磁架上，完全去除残留液体，并在管或板在机架上打开盖子的情况下干燥珠子 5-10 分钟。

15.  将 DNA 靶珠洗脱到 12 µl 无菌水中。通过移液充分混合。将管或板放在磁架上，直到溶液澄清。

16.  将 10 µl 上清液转移到干净的 PCR 条或 96 孔 PCR 板中。

    注意：如果样品要在下一个方案之前储存，请将它们转移到 -15 到−30°C 冰箱。

1.  根据表10，在PCR条带或96孔PCR板中制备每个样品的第一阶段PCR混合物。用移液管上下轻轻混合。

表 10. 为每个样品准备第一阶段 PCR 混合物

零件	每个样品 (µl)
QIAseq RNA 5x 缓冲液	5
LA 引物混合物（每种 100 nM）	5
RS2 引物（10 µM）	1.5
来自先前方案的纯化产物	10
HotStarTaq DNA 聚合酶 (6 U/µl)	1
无 DNase 水	2.5
总容积	25

2.  用盖子或薄膜密封孔。将条带或板置于热循环仪中，并根据表11.

表 11. 热循环仪程序

循环次数	温度 (°C)	时间
1	95	15 分钟
8	95	15 秒
	60	5分钟
1	4	∞

3.  程序完成后，将反应置于冰上并使用 QIAseq Beads 进行样品纯化。
    注意：如果样品要在下一个方案之前储存，请将它们转移到 -15 到−30°C 冰箱。

将 QIAseq Beads 置于室温下30 分钟，并在使用前充分混合。

1.  将 25 µl PCR 反应转移到 1.5 ml LoBind 管中，或将其留在 96 孔 PCR 板中进行纯化。

2.  将 40 µl（1.6x 体积）QIAseq Beads 添加到 25 µl PCR 反应中。通过上下吹打至少 10 次充分混合。

3.  在室温下孵育 5 分钟。

4.  将试管或 96 孔 PCR 板放在磁架上，以将珠子与上清液分离。溶液澄清后（约 2 分钟），小心取出并丢弃上清液。小心不要干扰珠子，因为它们含有目标DNA。

5.  快速旋转试管或轻敲板以将任何残留液体沉淀到板底部，然后完全去除残留的上清液。

6.  将 200 µl 新鲜制成的 80% 乙醇加入磁架上的试管或平板中。旋转管子或在磁铁的 2 个位置之间左右移动板以清洗磁珠，然后小心地取出并丢弃上清液。

7.  重复步骤6 再一次。

8.  短暂旋转管或板，或轻轻（避免飞溅）将板轻敲在桌面上，以将任何残留液体沉淀到孔的底部（目视确认这一点）。放置在磁架上，完全去除残留液体和干燥珠子 5-10 分钟，同时将管或板放在架子上并打开盖子。

9.  将 DNA 靶珠洗脱到 27 µl 无菌水中。通过移液充分混合。

10.  将管或板放在架子上，直到溶液澄清。

11.  将 25 µl 上清液转移到透明 PCR 条或 96 孔板中。
    注意：如果要在下一个方案之前储存样品，请将它们转移到 -15 至 -30°C 的冰箱中。

1.  根据表 12（Illumina 平台）或表 13（Ion Torrent 平台）在 PCR条或板中为每个样本准备通用样本索引 PCR (uPCR) 混合物。通过上下吹打轻轻混合。

表 12. 为 Illumina 平台准备通用索引 PCR

零件	每个样品 (µl)	HT 阵列 (µl)
QIAseq RNA 5x 缓冲液	10	10
RS-D# (4 µM)*	2.5	–
FS-D# (4 µM)*	2.5	–
来自先前操作步骤的纯化产品	25	25
HotStarTaq DNA 聚合酶 (6 U/µl)	2	2
无DNA酶水	8	13
总容积	50	50

*当使用QIAseq靶向RNA 96索引HT阵列时，添加不含DNase的水，而不是索引引物。

表 13. 为 Ion Torrent 平台准备通用索引 PCR

零件	每个样品 (µl)	HT 阵列 (µl)
QIAseq RNA 5x 缓冲液	10	10
FS-trP1 (4 µM)*	2.5	–
RS-ID# (4 µM)*	2.5	–
来自先前操作步骤的纯化产品	25	25
HotStarTaq DNA 聚合酶 (6 U/µl)	2	2
无DNA酶水	8	13
总容积	50	50

*当使用 QIAseq Targeted RNA 96-index HT Array 时，添加无 DNase 水而不是索引引物。

2.  用盖子或薄膜密封孔。将条带或板置于热循环仪中，并根据表 14。

表 14. 热循环仪程序

循环次数	温度 (°C)	时间
1	95	15 分钟
n（参考表15)	95	15 秒
	60	2 分钟
1	4	∞

表 15. x-plex 水平的通用索引 PCR 循环数

X-plex 级别*	n个循环
x ≤ 50	24
50<x≤100	22
100<x≤400	20
400<x≤1000	18

*请参阅特定于面板的规格表或 qiagen.com 以确定 x-plex 级别。

3.  程序完成后，将反应置于冰上并使用 QIAseq Beads 进行样品纯化。

    注意：如果样品要在下一个方案之前储存，请将它们转移到 –15 到−30°C 冰箱。

将 QIAseq Beads 置于室温下30 分钟，并在使用前充分混合。

1.  将 50 µl PCR 反应转移到 1.5 ml LoBind 管中，或将其留在 96 孔 PCR 板中进行纯化。

2.  将 55 µl（1.1x 体积）QIAseq Beads 添加到 50 µl 反应中。通过上下吹打至少 10 次充分混合。

3.  在室温下孵育 5 分钟。

4.  将管或板放在磁架上以将珠子与上清液分离。溶液澄清后（约 2 分钟），小心取出并丢弃上清液。小心不要干扰珠子，因为它们含有DNA靶标。

5.  快速旋转试管或轻敲板以将任何残留液体沉淀到板底部，然后完全去除残留的上清液。

6.  将 200 µl 新鲜制成的 80% 乙醇加入磁架上的试管或平板中。旋转管子或在磁铁的两个位置之间左右移动板以清洗珠子，然后小心地取出并丢弃上清液。

7.  重复步骤6 再一次。

8.  短暂旋转管或板，或轻轻（避免飞溅）将板轻敲在桌面上，以将任何残留液体沉淀到孔的底部（目视确认这一点）。放置在磁架上，完全去除残留液体和干燥珠子 5-10 分钟，同时将管或板放在架子上并打开盖子。

9.  将 DNA 靶珠洗脱到 27 µl 无菌水中。通过移液充分混合。

10.  将管或板放在架子上，直到溶液澄清。

11.  将 25 µl 上清液转移到干净的 LoBind 管或板中，然后进入 QIAseq Library Quant 或 Bioanalyzer 进行测量。
    注意：如果要在下一个方案之前储存样品，请将它们转移到 –15 到 -30°C 的冰箱中。