开始前的要点

· 该方案针对所有物种的单细胞材料进行了优化，包括：脊椎动物、细菌（革兰氏阳性和革兰氏阴性、流式分选细胞、组织培养细胞、显微操作细胞和来自冷冻切片的激光显微切割细胞。该方案不能与用福尔马林或其他交联剂固定的细胞（例如，通过激光显微切割从福尔马林固定的石蜡包埋组织中获得的单细胞样品）。

· 使用 QIAseq FX Single Cell DNA Library Kit 的 1–1000 个完整细胞（例如，真核细胞或细菌细胞）样本是全基因组扩增反应的最佳选择。

· 如果从纯化的 DNA 而非完整细胞开始，请确保 DNA 是高质量的（高分子量 DNA 且不含抑制剂，如溶剂和去污剂）并悬浮在 TE 中。如果使用真核 DNA，我们建议使用 1–10 ng；对于细菌 gDNA，我们建议使用 6–100 pg。

· 通过使用单独的实验室设备（例如移液器、过滤移液器吸头、反应瓶等）避免试剂的 DNA 污染。在没有 DNA 的位置设置 REPLI-g 单细胞反应。

· REPLI-g sc DNA 聚合酶应在冰上解冻（参见步骤 6）。所有其他组件都可以在室温 (15–25°C) 下解冻。

· 缓冲液 D2（变性缓冲液）的保存时间不应超过 3 个月。

· 由于在 REPLI-g 单细胞反应期间通过引物二聚体的随机延伸产生 DNA，因此阴性（无模板）对照中可能存在高达 20 μg 的 DNA 产量
– 生成高分子量产物。该 DNA 不会影响实际样品的质量，也不会在下游检测中给出阳性结果。

开始前要做的事情

· 通过向提供的试管中加入 500 μl H2O sc 来制备 Buffer DLB。彻底混合并短暂离心溶解。
  注意：重构的 Buffer DLB 可在 –20°C 下保存 6 个月。缓冲液 DLB 是 pH 不稳定的。

· 所有缓冲液和试剂在使用前都应涡旋以确保充分混合。

· 将可编程热循环仪或加热块设置为 30°C。

· 如果热循环仪与加热盖一起使用，则盖的温度应设置为 70°C。

程序
1.  在室温下解冻 H2O sc、DTT 和 RepliG 反应缓冲液，涡旋，然后短暂离心。 REPLI-g sc Reaction Buffer 解冻后可能会形成沉淀。涡旋 10 秒后沉淀物将溶解。

2.  为全基因组扩增反应的总数准备足够的缓冲液 D2（变性缓冲液）（表 2）。
    注意：表 2 中给出的 Buffer D2 的总体积足以进行 12 次反应。如果执行较少的反应，请将剩余的 Buffer D2 储存在 –20°C。缓冲液 D2 的储存时间不应超过 3 个月。

表 2. 12 次反应的缓冲液 D2 的制备

零件	12 个反应的体积
数字地面电视，1 M	3微升
缓冲液 DLB（重组）*	33微升
总容积	36微升

*缓冲区 DLB 的重构在第 16 页的“开始前要做的事情,”中进行了描述。

3.  在 H2O sc 中为反应总数准备足够的 1:10 稀释 DTT（表 3）。

表 3. 12 个反应的 DTT 1:10 稀释液的制备

零件	12 次反应的体积*
数字地面电视，1 M	3微升
水蒸汽	27微升
总容积	30微升

* 增加 10%。

4.  将 4 μl 细胞材料（与 PBS 一起提供）或 gDNA 放入 96 孔板或微量离心管的每个孔中。如果使用少于 4 μl 的起始材料，添加 PBS sc 使体积达到 4 μl。
    注意：在移液过程中，避免移液器吸头和细胞材料接触。

5.  添加 3 μl 缓冲液 D2。轻轻轻弹试管并短暂离心，小心混匀。
    注意：确保细胞材料不会粘在缓冲线上方的管壁上。在移液过程中，避免移液器吸头与细胞材料发生任何接触。

6.  在 65°C 下孵育细胞制剂 10 分钟，在室温下孵育 gDNA 制剂 3 分钟，然后冷却至 4°C。
    注意：如果使用热循环仪，加热盖的温度应设置在 70°C 以避免蒸发。或者，可以在加热块中进行孵育。

7.  加入 3 μl 终止溶液。通过轻弹试管和离心机小心混合。储存在冰上。

8.  在冰上解冻 REPLI-g sc DNA 聚合酶。轻轻地倒在试管上，进行短暂的混合和离心。

9.  根据表 4 准备主混合物。简单地混合和离心。
    重要提示：按表 4 中列出的顺序添加主混合物组分。添加水、REPLI-g sc 反应缓冲液和 DTT 后，在添加 REPLI-g sc DNA 聚合酶之前短暂涡旋并离心混合物。加入 REPLI-g sc DNA 聚合酶后，小心轻弹并短暂离心。预混液应保持在冰上，并在加入 REPLI-g sc DNA 聚合酶后立即使用。
    注意：如果通过准备足以满足总反应次数的预混液同时进行多个反应，请相应地扩大规模。

表 4. 主混合物的制备*

零件	体积/反应
水蒸汽	6.5 微升
REPLI-g sc 反应缓冲液	29微升
数码地面电视 (1:10)	2.5 微升
REPLI-g sc DNA聚合酶	2微升
总容积	40微升

*要为多个反应准备预混液，请根据反应次数放大并添加 10%。

10.  对于每个扩增反应，将 40 μl 预混液添加到 10 μl 变性 DNA（从步骤 7 开始）。轻弹试管并短暂离心混合。

11.  在 30°C 下孵育 2 小时。
    注意：将样品孵育 2 小时可产生足够的 DNA，用于使用该试剂盒进行无 PCR 文库制备。也可以孵育 1 小时，但会导致产量降低，并且可能不适用于所有类型的细胞。
    如果在步骤 11 中使用相同的加热块，在 30°C 孵育后，将加热块加热至 65°C。
    注意：如果热循环仪与加热盖一起使用，则盖的温度应设置为 70°C。

12.  在 65°C 下灭活 REPLI-g sc DNA 聚合酶 3 分钟。

13.  如果不直接使用，将扩增的 DNA 储存在 4°C 以进行短期储存，或者在–20°C 用于长期储存。
使用 QIAseq FX Single Cell DNA Library Kit 扩增的 DNA 应作为基因组 DNA 处理，并进行最少的冻融循环。我们建议以至少 100 ng/μl 的浓度储存核酸。

14.  扩增的 DNA 可直接用于文库构建。此外，额外扩增的 DNA 可用于 PCR 分析或靶向重测序。
    注意：要继续进行文库制备，您可以按照附录 B（第 29 页）中的说明对扩增的 DNA 进行定量。光密度 (OD) 测量高估了 REPLI-g 扩增的 DNA，不应使用。典型的 DNA 产量约为每 50 μl 反应 40 μg。

    附录内容可在QIAGEN官网下载货号为180713的完整说明书。

开始前的要点

· 该操作步骤用于使用 QIAseq FX Single Cell DNA Library Kit 为 Illumina NGS 平台构建测序文库。

· 该方案还需要以下 QIAGEN 产品：用于在文库构建后进行反应净化和去除接头二聚体，Agencourt AMPure XP Beads（货号 A63880、A63881）或 GeneRead Size Selection Kit（货号 180514）是必需的，应单独订购。

· 扩增的 DNA 在开始前应在 H2O 中稀释。

开始前要做的事情

· 程序热循环仪。为了提高速度和便利性，操作步骤的所有孵育步骤都可以预先编程并保存在热循环仪上（表 5）。
请参阅表 5 以确定将输入 DNA 片段化为所需大小所需的时间和方案。

· 准备新鲜的 80% 乙醇。准备缓冲液 10 mM tris-HCl,PH8.0

 

程序：酶裂解和文库制备

FX Single-Tube 碎片、末端修复和 A-addition
1.  在冰上解冻所有套件组件。一旦试剂解冻，通过快速涡旋彻底混合缓冲液以避免任何局部浓度。使用前短暂旋转涡旋试剂。
   根据表 5 对热循环仪进行编程并启动程序。如果可能，将加热盖的温度设置为 ~70°C。

2.  当热循环仪模块达到 4°C 时，暂停程序。

表 5. 扩增的 gDNA 片段化反应条件

步	温度	孵育时间（片段大小 300 bp）	孵育时间（片段大小 500 bp）
1	4°C	1 分钟	1 分钟
2	32°C	15 分钟*	10 分钟
3	65°C	30分钟	30分钟
4	4°C	抓住	抓住

*已完成文库的插入大小由步骤 2 的持续时间决定。使用 200–1000 ng 输入 DNA 和 FX 增强剂，15 分钟的片段化时间产生约 300 bp 的片段分布，如果不使用增强剂，则为 500 bp。可以增加或减少碎片时间以分别生成更短或更长的插入物。使用带加热盖的热循环仪。

3.  在 H2O sc 中稀释扩增的 gDNA 1:10。此步骤应在 10 μl H2O sc (20-100 ng/μl) 中提供 200–1000 ng 总扩增 DNA。如果您已对从 WGA 获得的 DNA 进行了定量，则在 FX 反应中输入的未稀释 DNA 不得超过 5 μl。在 PCR 管或条带中吸取 10 μl 稀释的 DNA，并将它们放在冰上或冷却块上。

4.  如果所需的文库片段大小为 300 bp，则根据表 6 在冰上准备 FX 反应混合物，或根据表 7 准备 500 bp 的文库片段大小 - 并通过移液混合。按照表中所述的相同顺序添加 FX Reaction Mix 的组分。在添加 FX 酶混合物之前，用移液器上下移液器混合物。您可以根据所需的样品数量扩大 FX Reaction Mix。

表 6. 插入 300 bp 片段大小的 FX 反应设置

零件	体积/反应*
FX 缓冲器，10x	5微升
水蒸汽	20微升
效果增强器	5微升
FX 酶混合物	10微升
总反应体积	40微升

*通过移液混合并保持在冰上。

*表 7. 插入 500bp 片段大小的 FX 反应设置

零件	体积/反应*
FX 缓冲器，10x	5微升
水蒸汽	25微升
FX 酶混合物	10微升
总反应体积	40微升

*通过移液混合并保持在冰上。

5.  将 40 μl FX Reaction Mix 添加到冰上每个稀释的扩增 gDNA 样品中，并轻轻涡旋混合。

6.  短暂旋转 PCR 板/管，立即转移到预冷的热循环仪 (4°C) 并恢复程序。碎片程序完成后，将样品转移到冰上。

7.  立即按照下一个操作步骤中的说明进行适配器连接。

适配器连接
8.  使用前将 Agencourt AMPure XP 微珠平衡至室温 20-30 分钟。

9.  涡旋并向下旋转适配器板。取下保护性适配器板盖，小心地刺穿箔密封并将 5 μl 从一个 DNA 适配器孔转移到前一个方案中的每个 50 μl 样品中。跟踪用于每个样品的条形码。

10.  更换适配器板盖并冷冻未使用的适配器。转接板在至少 10 次冻融循环中是稳定的。
    重要提示：每个连接反应只能使用一个接头。如果使用其他供应商的适配器，请遵循制造商的说明。

11.  根据表 8 在冰上的单独试管中制备连接预混液（每个 DNA 样品）。通过在低转速下轻轻涡旋充分混合。

表 8. 连接预混液（每个样品）

零件	体积/反应*
DNA 连接酶缓冲液，5x	20微升
水蒸汽	15微升
DNA连接酶	10微升
总反应体积	45微升

通过移液混合并保持在冰上。

12.  在每个样品中加入 45 μl 的连接预混液。充分混合并在 20°C 下孵育 15 分钟。
    重要提示：请勿使用带加热盖的热循环仪。

13.  使用 0.8x (80 μl) Agencourt AMPure XP 珠子立即进行接头连接清理（步骤 14–23）。

14.  将 80 μl 重悬的 Agencourt AMPure XP 珠浆添加到每个连接的样品中，并通过移液器或轻轻涡旋充分混合。

15.  在室温下孵育混合物 5 分钟。

16.  将磁珠放在磁性支架上 2 分钟，然后小心丢弃上清液。

17.  通过向每个颗粒中加入 200 μl 新鲜的 80% 乙醇来清洗磁珠。将珠子放在上面磁力架 2 分钟，然后小心弃去上清液。

18.  重复洗涤步骤 17 一次，总共进行 2 次乙醇洗涤。

19.  在磁力架上孵育 5-10 分钟或直到珠子变干。避免过度干燥，这可能会导致 DNA 回收率降低。从磁性支架上取下。

20.  通过重悬于 52.5 μl 10 mM Tris-HCl，pH 8.0 中进行洗脱。磁力架上的颗粒珠。小心地将 50 μl 上清液转移到新的 PCR 板上。

21.  进行第二次纯化。向每个样品中加入 50 μl 重悬的 1x Agencourt AMPure XP 微珠并混合。

22.  按照步骤 15–19。

23.  通过重悬于 26 μl 10 mM Tris-HCl，pH 8.0 中进行洗脱。将磁珠放在磁力架上。小心地将 23.5 μl 上清液转移到新的 PCR 板中。将纯化的文库储存在 –20°C 直至准备好进行测序。

24.  使用毛细管电泳设备或类似方法评估库的质量。检查库片段的正确大小分布（图 1）以及是否缺少适配器或适配器二聚体。
    注意：DNA 片段的中值大小应根据与库片段连接的接头的大小（~120 bp）进行移动。
    注意：中间片段大小可用于后续基于 qPCR 的量化方法。

图 1. 生成库的毛细管电泳设备跟踪。毛细管电泳设备跟踪数据显示 4 个复制完成的文库的正确大小分布以及不存在接头或接头二聚体。

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25.  使用 QIAseq Library Quant Assay Kit（产品编号 333314，本试剂盒未提供）或其他类似方法对文库进行量化。
    注意：强烈建议使用 qPCR 进行文库定量，以确保准确的文库稀释和流动池加载。不准确的文库定量可能会导致流通池聚类不足或过度聚类。毛细管电泳或 Qubit®方法可能会高估文库数量，因为它们无法区分带有和不带有接头的 DNA 片段。但是，如果需要 Qubit® 量化，我们建议在 Qubit 量化之前先扩增文库（参见附录 D，第 37 页）。
    使用 200 ng – 1 μg WGA DNA 输入，应生成足够的文库以在 Illumina 平台上进行聚类，而无需进一步 PCR 扩增（图 2）。

图 2：文库产量与 WGA DNA 输入的关系。绘制的是用 SD 进行三次反应的方法。

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26.  纯化后的文库可在 –20°C 下安全储存，直至进一步应用或扩增。 LoBind 管应用于存储文库。