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多重PCR在同一反应中使用不同的引物对来同时扩增多个靶标。这种类型的PCR通常需要广泛优化退火条件，以最大限度地提高不同引物－模板系统的扩增效率，并且经常受到非特异性PCR伪影的影响。严格的热启动程序和特别优化的缓冲系统对于成功的多重PCR至关重要。
与标准PCR系统相比，多重PCR的另一个挑战是不同引物对的不同杂交动力学。高效结合的引物可以利用更多的PCR反应组分，从而降低其他PCR产物的产量。这通常导致未扩增的DNA序列和缺乏预期的PCR产物。商业PCR试剂盒是专门为克服多重PCR的挑战而设计的，建议在可能的情况下使用这种试剂盒。
本流程以QIAGEN货号：206143为例，可兼容1ngDNA；一次反应可完成即使甚至上百个目标分子的扩增；适用于文库构建前的预扩增。
实验步骤
- 1
- 2
-
方案一：标准多重PCR(不超过1.5kb)
(1)混合样本和试剂
将2× QIAGEN多重PCR预混液(2x QIAGEN Multiplex PCR Master Mix)、模板DNA、无RNA酶水、引物以及Q-solution(可选)从冰箱中取出解冻。使用前请混匀；
(2)按下表准备反应混合液
多重PCR反应体系；
成分
体积/反应
终浓度
2x QIAGEN Multiplex PCR Master Mix
25μl
1x*
10x primer 混合物（每条2 μM ）
5μl
每条引物0.2 μM
无RNA酶水
可变
-
可选：5x Q-Solution†
10 μl
1x
模板DNA（步骤4加入）
可变
每反应不超过1 μg
反应总体积
50 μl
* 含3mM Mg2+
注：反应混合液通常包含了除模板外所有多重PCR反应需要的成分。为了应对吸液枪黏附液体所造成的误差，请比实际需要量多预备10%的反应混合液；
(3)分装
轻轻吹打反应混合液数次以充分混匀。将反应混合液按需要的体积分装到PCR管中或PCR板中。反应准备过程不必在冰上进行；
(4)加样至PCR板
将DNA模板(50μl反应体系不大于1μg)加入每个PCR管或孔中。如果进行的是多重反转录PCR，则将反转录产物加入对应管中，加入反转录产物的体积不能超过PCR反应体系的10%；
(5)按表中的反应条件设置PCR仪。
(6)放入PCR管或PCR板，按下表条件开始反应。标准多重PCR循环条件
设置
时间
温度
初始热激活
15 min
95°C
变性
30 s
94°C
30—45个循环
退火
90 s
57-63°C
延伸
90 s
72°C
最终延伸
10 min
72°C
* 如果产物大于1.5kb，可将延伸时间增加到2min
注：扩增后的样品可在2-8°C保存过夜或在-20 °C长期保存。
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方案二：微卫星位点或小扩增子(不超过0.5 kb)多重PCR
(1)同方案一的步骤1,2,3,4；
(2)按下表设置PCR反应条件；
(3)放入PCR管或PCR板，按下表条件开始反应；
(4)微卫星位点或小扩增子多重PCR循环条件。
设置
时间
温度
初始热激活
15min
95°C
变性
30s
94°C
25—40个循环
退火
90s
57-63°C
延伸
60s
72°C
最终延伸
30min*
60°C
* 使扩增产物末端生成A-突出，以便下游使用毛细管电泳或凝胶>DNA测序仪进行高分辨率分析
注：扩增后的样品可在2-8°C保存过夜或在-20 °C长期保存。