7.3.2 什么是相对定量？

7.3.1 什么是绝对定量？ | 7.3.3 PCR中常见关键词与FAQ

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在相对定量中，确定靶基因和对照基(例如，存在于所有样品中的内源性参考基因)的量之间的比率。然后在不同的样本之间比较该比率。在基因表达分析中，通常选择管家或维持基因作为内源性参考。从同一样品中分别或在同一反应中扩增靶基因和参考基因(双链、实时PCR)。为每个样品确定归一化值，并且可以用于例如比较不同组织中基因的差异表达或者比较siRNA转染的细胞和未转染的细胞之间的基因表达。然而，内源性参考基因的表达水平在不同的实验条件下或在组织的不同状态下不得变化(例如，“刺激”样品与“未刺激”样品)。当在样品之间比较基因表达水平时，靶的表达水平被称为，例如，在受刺激细胞中比在未受刺激细胞高100倍。定量程序的不同取决于靶基因和内源性参考基因是以可比较的还是不同的效率扩增。

本章节主要介绍：如何使用qPCR计算基因调控效率？
qRT-PCR(实时荧光定量PCR)是RNAi的标准检测方法，这里就以siRNA沉默mRNA的案例来展示如何进行计算。
本案例采用实时一步RT-PCR分析CDC2基因敲除情况。RNAi实验的步骤流程如下：

实验步骤

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步骤一

siRNA转染——HeLa S3细胞转染靶向人类CDC2基因的0.5nM siRNA、阴性siRNA对照(与任何已知的哺乳动物基因没有同源性的非沉默对照siRNA)。并添加未转染细胞作为对照。
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步骤二

RNA纯化——48小时孵育后，收集细胞，使用试剂盒纯化RNA。
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步骤三

使用以上RNA为模板进行qRT-PCR。使用一步法qRT-PCR试剂盒，(逆转录反应和扩增在同一试管中进行)。进行CDC2和GAPDH(一种管家内源性参考基因)的基因特异性定量。

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qRT-PCR还需要注意以下内容

(1)无模板对照NTC：这是一个无模板RNA，可用ddH₂O补足，包含扩增反应的所有成分。NTC可以检测到qRT-PCR反应组分中可能存在的任何污染。

(2)内源性内参基因的标准化：内源内参基因是指表达水平在样本之间不存在差异的基因。将目的基因与内源性内参基因进行比较，可纠正RNA含量的变化和样本处理中的其他差异。在本实验中，使用管家基因GAPDH进行归一化。

(3)来自未转染细胞的模板：对未转染对照的分析显示，在没有任何处理的情况下，基因表达水平。

(4)来自阴性siRNA对照的模板：将转染阴性siRNA对照的细胞中的靶基因表达与转染基因特异性siRNA后的基因表达进行比较，计算基因敲除率。未转染对照组的基因表达水平应与转染阴性siRNA对照组观察到的水平进行比较。二者基因表达应该是相似。这两个样本之间的任何基因表达差异都是由非特异性效应引起的。

(5)每个样本至少重复2次：重复实验对于解释样本间的变化很重要，以确保数据是可靠和稳健的。至少应进行2次重复实验，重复之间的差异应较低。为了确保变异是可接受的低水平，计算变异系数（%Cv=（标准偏差（重复）/平均CT（重复））x100）。这一点应该始终低于3%。

步骤四

结果分析：获取到可信的CT值，进行计算。

本实验数据如下：

分组CT值	CDC2-specific PCR3个重复	平均值	GAPDH-specific PCR3个重复	平均值
转染CDC2细胞	26.04 26.20 26.42	26.22	15.27 15.38 15.81	15.49
转染阴性siRNA对照细胞	22.90 23.13 22.34	22.79	15.18 15.41 15.25	15.28

使用∆∆CT方法计算siRNA沉默效率，计算公式如下：

靶基因表达=2-∆∆CT
∆CT (样本) = CT 靶基因– CT内参基因
∆CT (对照) = CT 靶基因 – CT内参基因
∆∆CT = ∆CT (样本) – ∆CT (对照)

本实验数据带入公式计算：

∆CT(样本) = 26.22 – 15.49 = 10.73
∆CT (对照) = 22.79 – 15.28 = 7.51
∆∆CT= 10.73 – 7.51 = 3.22
样本中靶基因表达= 2^-3.22 = 0.107，CDC2 siRNA对样本的沉默效率为：100%-10.7% = 89.3%
一般来说，下调70%或以上被认为是显著高的。然而，根据细胞类型、靶基因和下游检测的不同，较低的敲低水平可能也就足以用于RNAi研究。

其他的基因调控实验，如miRNA mimic，cDNA等均可以使用同样的方法进行计算。