9.1 对照

无模板对照(NTC)允许检测PCR试剂的污染。NTC反应包含除模板外的所有实时PCR成分。在NTC反应中检测到阳性信号表明存在污染核酸；

在进行基因表达分析时，应包括无RT对照，即在没有逆转录酶的情况下进行实时RT-PCR。对于病毒载量监测，根据检测到的病毒种类的样本类型和生命周期，可能需要进行无RT控制。由于逆转录不能发生，因此无RT对照反应可以检测污染DNA，例如来自整合到宿主基因组中的病毒序列的DNA。在开始RT-PCR之前，可以通过DNA酶处理去除RNA样本中的污染DNA；

内部阳性对照可用于检测PCR抑制剂的存在。进行双链反应，其中用一个引物－探针组扩增目标序列，用不同的引物－探针集扩增对照序列(即内部阳性对照)。内部阳性对照应具有足够高的拷贝数，以便进行准确检测。如果检测到内部阳性对照，但目标序列没有，那么这表明扩增反应成功，并且目标序列不存在(或者拷贝数太低而无法检测)。

有几个因素会产生假阴性结果，例如样本提取错误或热循环器故障。由于PCR或RT-PCR抑制导致的检测失败是最常见的原因。

控制抑制剂存在的最实用方法是包括内部阳性对照或内部控制(IC)。该IC在与病原体靶标相同的管中同时提取和扩增(或仅扩增)，并且应始终与外部阳性对照相结合，以证明反映混合物用于扩增靶标的功能。这种组合排除了抑制和其他故障，并证实了负面结果确实是负面的。

并非所有的内部控制都是相同的，每个IC都有特定应用的价值。内源性IC在测试样本中自然发生，例如宿主基因组的序列(例如，ß-actin)或正常微生物群落基因组(例如，16s)。另一方面，外源IC在核酸提取过程中或PCR扩增前掺入样品中。

外源IC可以是同源的，其中人工模板是用于靶向病原体序列相同的引物结合位点构建的。尽管靶标和IC使用相同的引物组，但序列不同，从而能够用不同的探针分化病原体和IC扩增子。另一方面，异源IC是用它们自己的引物和探针设计的。

由于反应组分的竞争，内源性和外源性同源IC具有损害病原体靶标检测灵敏度的风险。例如，高起始量的内源性IC模板可以损害测定灵敏度。这种高起始量可能是由于样本类型或采样技术的变化而导致的。在RNA应用的情况下，高起始量也可能是由于疾病相关的细胞病理导致IC的表达水平提升。在外源同源IC的情况下，使用相同的引物来扩增靶标和IC会导致引物竞争。此外，内源性和同源IC都涉及繁琐的IC设计，并且它们的使用仅限于少数应用甚至单个测定。