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5.2.1 Naveni® PD1/PD-L1 AP

| 5.2.2 NaveniFlex Cell MR试剂盒

该流程按照Navinci的Naveni® PD1/PD-L1 AP试剂盒(货号:NPT.PDL1.AP.100)来进行,如果用的是其他品牌的试剂盒,可以参考其说明书进行操作。本试剂盒用于原位特异性检测 PD1/PD-L1 相互作用。
效果图:
 

图1.胰腺导管癌(AP 基质)中的 PD1/PD-L1 相互作用
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图2.扁桃体组织中的 PD1/PD-L1 相互作用,HRP 底物
△点击放大图片

实验步骤

  • 1
  • 2
  • 3
  • 4
  • 5
  • 6
  • 7
  • 8
  • 9
  • 10
  • 1

    样品制备

    1. 抗原修复后,加入足够的碱性磷酸酶/辣根过氧化物酶封闭液(用于猝灭)以覆盖每个样本,根据厂家的用户指南进行孵化;
    2. 用1x TBS-T清洗载玻片2x5分钟;
    3. 准备两瓶1X TBS-T,将一瓶预热至37℃,并预热所需数量的染色瓶。

  • 2

    封闭样本

    1. 在每 40 µL 封闭缓冲液(1x)中加入 5 µL 补充剂 1,配制封闭溶液(表1);
    2. 封闭液加入整个样品区域,每 1 平方厘米区域约 40 微升;
    3. 在 37 °C 的预热湿盒中培养 60 分钟。

  • 3

    一抗孵育

    1. 在每 40 µL 抗体稀释液(1x)中加入 5 µL 补充剂 2,制备一抗溶液(表 1);
    2. 用配制的一抗溶液将 PD1 和 PD-L1 抗体稀释至 1 倍(各稀释 1:40);
    3. 倒掉玻片上的封闭液,用 1x TBS-T 冲洗 2x 3 分钟;
    4. 加入足够的稀释抗体以覆盖样本区域;
    5. 在 37 °C 下孵育 60 分钟,或在 4 °C湿盒中孵育过夜。
    6. 倒出抗体溶液,在染色瓶中用 1x TBS-T 冲洗玻片 3x 5 分钟。

    表1:封闭溶液和一抗溶液
    △点击放大图片

  • 4

    Navenibody抗体(二抗)孵育

    1. 将 Navenibody M1 和 Navenibody R2 以 1:40 的比例稀释在 Navenibody 稀释液(1x)中;
    2. 加入足量的 Navenibody 工作溶液,以覆盖样品区域;
    3. 在预热的湿盒中 37 °C孵育 60 分钟;
    4. 倒掉NaveniBody溶液;
    5. 用染色瓶中预热的 1x TBS-T 清洗切片 2 次,每次 10 秒,每次 15 分钟;单独清洗对照组。

  • 5

    反应1

    1. 用蒸馏水以 1:5 稀释缓冲液 1,涡旋混匀;
    2. 在稀释缓冲液中加入酶1,稀释比为 1:40,制备反应 1。用移液器轻轻混合,然后涡旋混匀;
    3. 加入足够体积的反应 1 以覆盖样品区域;
    4. 在 37 °C 的预热湿盒中孵育 30 分钟;
    5. 在染色瓶中用 1x TBS-T 冲洗玻片 2x 3 分钟。

  • 6

    反应2

    1. 用蒸馏水以 1:5 稀释缓冲液 2,涡旋混匀;
    2. 在稀释缓冲液中加入酶 2 ,稀释比为1:40,制备反应 2。用移液器轻轻混合,然后涡旋混匀;
    3. 加入足够体积的反应 2 以覆盖样品区域;
    4. 在预热的湿盒中 37 °C 下孵育 90 分钟。

  • 7

    孵育 AP

    1. 倒出溶液,在 1x TBS 中清洗玻片 2x 5 分钟,然后在染色瓶中的 0.1x TBS 中清洗 1x 10 分钟;
    2. 用 AP 稀释液按 1:300 稀释 AP 试剂;
    3. 从玻片中倒掉洗涤缓冲液;
    4. 加入足量的 AP 溶液以覆盖样品区域;
    5. 室温下在摇床上缓慢搅拌培养 30 分钟。

  • 8

    酶底物孵育

    1. 倒出溶液,在染色瓶中用 1x TBS 冲洗玻片 2x 2 分钟;
    2. 将 AP 底物1(稀释 62.5 倍)和 AP 底物 2(稀释 80 倍)在 AP底物稀释剂中混合,制备底物溶液;

    表2:最小反应体积的计算
    △点击放大图片

    3. 从玻片中倒掉洗涤缓冲液;
    4. 加入第一份底物溶液,覆盖样品区域;
    5. 将载玻片与底物在室温下孵育 25 分钟;
    6. 倒出载玻片上的底物溶液,用去离子水清洗载玻片 2x 2 分钟。

  • 9

    核染色

    1. 从载玻片中倒掉洗涤缓冲液;
    2. 加入足够的核染色剂以覆盖样本区域;
    3. 室温下孵育 2 至 10 秒钟;
    4. 用流动的自来水(非去离子水)冲洗玻片。

  • 10

    脱水和成像

    1. 用水清洗玻片 5 分钟;
    2. 用异丙醇清洗玻片 2 次,每次 1 分钟,快速脱水;
    3. 擦去玻片上多余的异丙醇,涂上 VectaMount® Express 基底承载液 (H-5700-60);
    4. 盖上盖玻片,让载玻片在室温下晾干 10 至 20 分钟;
    5. 使用明亮视野的显微镜进行分析,至少使用 20 倍物镜;
    6. 成像后,在室温下保存玻片,信号可稳定数年。

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