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1.1.2 选择合适的表达载体

| 1.1.3 确定酶切位点

视频素材来源于JOVE  https://www.jove.com/cn/v/5060/bacterial-transformation-electroporation?language=Chinese
版权归原作者所有

常用的原核表达载体有pET15b,pET28a,pGEX4T1,pGEX-6p-1等。表达载体一般包括启动子,多克隆位点,抗性基因,标签基因等等。
表达载体的选择原则:
1)启动子是否为原核启动子;
2)标签基因是否是我们需要用的标签。
常用的标签的标签有His,GST,MBP,Strep,Flag标签等。以下对每个标签进行介绍。

实验步骤

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    常用标签选择

    △点击放大图片

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    His标签

    His标签:His标签由于其分子量小且价格便宜,是最常用的标签之一。His标签通常由6-10个氨基酸组成,利用多聚组氨酸对二价金属离子具有高选择性亲和力的特点,我们可以把金属离子(常用为Ni离子)通过NTA或者IDA连接在琼脂糖树脂上进行His标签的纯化。由于His标签较小,所以通常纯化后不用切除标签,并且可以和其他标签联用构成双标签。如果His标签纯化有杂带,可以考虑使用多个咪唑浓度梯度洗脱或者用仪器进行咪唑线性洗脱。

  • 3

    GST标签

    GST标签:GST标签也是常用的标签。GST标签全称为Glutathione S-transferase(谷胱甘肽巯基转移酶),可以特异性的结合其酶活底物谷胱甘肽。GST填料上固定有谷胱甘肽配基,可用于特异性纯化带有GST标签的蛋白。

    GST标签可以提高蛋白表达的可溶性和表达量,并且也具有较高的纯度。一般用GST标签纯化后的条带都比较单一,可以一步得到非常高的纯度。

    由于GST标签比较大,所以在纯化后通常需要将纯化后的蛋白上的GST标签切除。可以选择柱上酶切或者柱下酶切的方法。在构建质粒时,需要考虑到在GST标签和目的蛋白中间加上特定的蛋白酶酶切位点。

  • 4

    Strep标签

    如果想要得到非常高的纯度,或者蛋白有相近的难以去除的杂带,可以选择Strep标签。Strep标签为一段长度仅为8个氨基酸的短肽,可以结合链霉亲和素。而现在常用的Strep填料的配基为链霉亲和素改造之后的Strep-Tactin配基,大大增加了和Strep标签的结合能力。

    此外,Twin-Strep标签也受到很多客户的青睐。Twin-Strep标签是由两段Strep肽段和之间的连接序列构成的,和普通的Strep标签相比具有纯度更高,可耐受变性剂等特点。

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    MBP标签

    MBP标签全称为maltose Binding Protein(麦芽糖结合蛋白),分子量较大(42KD)。MBP填料上的糊精配基可以特异性的结合MBP标签蛋白。MBP标签具有促进重组蛋白溶解的功能,在过表达目的蛋白的过程中也有助于减少包涵体。

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