设计引物也有多个软件可以使用，这里介绍的是常用的Primer 5软件。
设计引物的基本原则是：
1）引物长度一般为15-30bp，常用的为18-27bp，但不能大于38bp；
2）引物GC含量一般为40%-60%，以45-55%为宜，上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；
3）引物所对应的模板序列的Tm值最好在72℃左右；
4）3'端最好不要是连续碱基，GGG或CCC会导致错误的引发，同时3'端最后一个碱基最好不要是A或T，否则容易导致错配；
5）以公式Tm=4*（G+C）+2*（A+T）-5计算Tm值，也就是退火温度。选择较低Tm值的引物的退火温度为反应的退火温度，最好保证每个引物的Tm值相匹配，且在70-75℃范围内；
6）在DNA测序和PCR中最好用5'末端稳定（GC含量多），而3'端不稳定（AT含量多）的引物，这种引物的结构可以有效地消除假引发反应；
7）引物和产物之间的Tm值相差别太大，20摄氏度范围内最好。

此外，在引物的两端需要加上酶切位点和保护碱基。
如果载体上没有标签序列，还需要在引物设计时加上标签序列。
以下对步骤进行梳理，详细操作请查看视频。