视频素材来源于YouTube https://www.youtube.com/watch?v=RmPsLoIPRwc
版权归原作者所有
拿到合成的引物之后，我们就可以进行目的基因的扩增了。合成目的基因通常是以目标物种的基因组为模板。
由于真核生物的基因组中存在内含子序列，在mRNA的剪接加工过程中被切除，因此，在构建真核基因克隆时基因组DNA不能直接用作PCR扩增的模板，只能从细胞或者组织中提取总RNA或者mRNA，反转录cDNA作为模板通过PCR扩增目的基因。
实验步骤
- 1
- 2
- 3
- 4
- 5
- 6
- 7
-
加Trizol，静置
从细胞培养箱中取出已经长满细胞的细胞培养皿，小心吸出培养基，加入4ml预冷PBS，倾斜细胞培养皿3次以充分洗涤细胞，然后小心吸尽PBS溶液。
培养皿中加入1ml Trizol试剂裂解细胞，冰上静置5min，枪头吹打，室温静置5min； -
加氯仿，离心
将细胞裂解液吸到1.5ml EP管中，加入氯仿0.2 ml，震荡仪震荡15s。
室温静置2-3min，12000xg，4℃，15min离心。 -
分层取上层
离心后液体分为三层（上层无色为RNA，中层为DNA，底层为蛋白质），小心吸取上层无色液体至新的EP管中。
-
加异丙醇，离心
加入等体积异丙醇，混匀，冰上静置10min，12000xg，4℃，10min离心。
此时在管底可见RNA白色沉淀，弃去上清。 -
加乙醇，离心，干燥
加入75%乙醇1ml，震荡仪震荡30s，7500xg，4℃，5min离心。
小心去上清，管 内沉淀在超净台中鼓风静置干燥3-5min。 -
加DEPC水溶解
加入20ul DEPC水溶解。水浴或者加热器55-60℃，10-15min。
-
测纯度和浓度
测定纯度和浓度。吸光度A260/280比值接近2表明纯度较高。