1、一抗的稀释比例:第一次使用参考抗体说明书的稀释比例进行，如果第一次使用之后发现抗体的灵敏度较高，条带很浓，可以适当降低抗体稀释浓度;

2、抗体稀释液:可以用含5%BSA或5%脱脂奶粉的TBST缓冲液来稀释抗体，但是如果前期实验发现背景很高的话，可以用5%脱脂奶粉的TBST缓冲液来稀释抗体;

3、抗体孵育的条件:4°C过夜孵育，此过程要在摇床上进行。

1、二抗的稀释比例:第一次使用参考抗体说明书的稀释比例进行，如果第一次使用之后发现抗体的灵敏度较高，条带很浓，可以适当降低抗体稀释浓度;

2、抗体孵育额条件:室温摇床上孵育1h即可，时间过长容易导致非特异性结合产生杂带高背景等;

3、二抗一次性使用，不要重复回收使用。

1、使用TBST进行洗涤;

2、如果前期实验条带很淡或者杂带较多，可以适当缩短或者延长洗膜时，和调整减小或加大洗膜时摇床的震荡频率;

3、在洗膜的过程中要保持膜处于湿润的环境下，防止干膜导致高背景。

1、所有用到保鲜膜的地方，一定要将保鲜膜放平整，不能有褶皱，以防ECL液分布不均匀，并要注意保鲜膜的完整，以防保鲜膜上有小洞，ECL液泄漏，导致反应不均匀;

2、ECL孵育结束时膜需要用吸水纸吸干，但是请注意不能让膜完全干掉，某些较弱的信号，膜彻底干掉后会检测不到，以及背景的增高。

整个操作过程中注意不能让膜干掉，用夹子夹膜时，尽量夹取无检测信号的一角