①样本不表达或者表达较低
选择合适的样本，进行适当的刺激处理

②样本制备不当
添加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂;注意制备样本的细节以及制备好之后的保存条件，防止蛋白降解;选择合适的细胞组分进行制样

③上样量太少
增加上样量，细胞推荐20-50ug，组织推荐50-100ug

①抗体选择不当
选择合适的抗体，包括种属，适用范围

②抗体保存不当
按照抗体说明书进行保存

③抗体孵育时间或浓度不足
延长抗体孵育时间，增加抗体孵育浓度

①转膜不当
根据目的蛋白分子量选择合适的膜;优化转膜电压、电流以及时间，转膜后用丽春红或者考马斯染料确认转膜效率

②封闭过度
减少封闭液浓度，减少封闭时间;确保不含高于0.1%的叠氮化钠

③显示剂失效
更换可正常使用的显色剂