通过查阅蛋白数据库、文献排除翻译后修饰、蛋白亚型、剪切体等情况

①样本降解
样本制备好进行分装，减少反复冻融;添加蛋白酶抑制剂;使用新鲜样本

②样本上样量过多
减少蛋白上样量

③样本未充分变性
制样时需添加足量的还原剂DTT或者BME，煮沸5-10分钟

①一抗非特异性结合
降低一抗浓度;一抗稀释液推荐使用5%脱脂牛奶;减少抗体孵育时间;选择高质量的单克隆抗体

②二抗非特异结合
可以通过不加一抗，只孵二抗的阴性对照判断二抗非特异性结合;降低二抗浓度;二抗稀释液推荐使用5%脱脂牛奶;减少抗体孵育时间;选择高质量的二抗

①封闭不足
更换封闭液;提高封闭浓度;延长封闭时间

②洗涤不足
推荐TBST中至少添加0.1%吐温20，增加洗涤的时间和次数;如果背景全黑，建议增加TBST中的NaCl浓度至500mM

③曝光过度
减少曝光时间

④其他
实验过程中使用到的各种缓冲液建议使用双蒸水来配置;抗体孵育过程中不能使膜变干;在操作和转移膜的过程中，应当使用专门的平头镊子轻拿轻放，避免皱褶和痕迹;转膜过程中的滤纸不要回收利用。