可靠地分离和转印高分子量(HMW)蛋白是生命科学研究人员面临的普遍挑战。
选择正确的凝胶是成功转印HMW蛋白的关键因素。
流行的通用凝胶是4%至20%的Tris-甘氨酸凝胶，可有效分离多种蛋白质。
但是，HMW蛋白将被压缩到凝胶顶部的狭窄区域。
对于HMW蛋白，更好的选择是Tris-乙酸凝胶或低百分比的非梯度Tris-甘氨酸或Bis-Tris凝胶。
当专门分析HMW蛋白时，可以使用Tris-乙酸凝胶实现最佳转印效果。
与 Bis-Tris 或 Tris-甘氨酸凝胶相比，Tris-乙酸凝胶保持中性 pH 值并以更高的分辨率分离HMW蛋白。
通过比较不同凝胶体系和梯度分离HMW蛋白质的效果，可以看到3‒8%的Tris-乙酸凝胶对HMW蛋白质的分离效果和分辨率是最理想的。
这种分辨率的提升会带来更高的转印效率和更高的灵敏度。
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Tris-乙酸凝胶分离 HMW 蛋白的效果最佳。
(A) 在黄色阴影区域获得理想的分离结果。
(B) 在4‒20%的Tris-甘氨酸凝胶上使用tris-乙酸凝胶可观察到更好的转印:
在Tris-乙酸凝胶上显示9ng，而在tris-甘氨酸梯度凝胶上显示620ng。
Tris-乙酸聚丙烯酰胺梯度凝胶试剂配方如下
Tris-乙酸聚丙烯酰胺梯度凝胶试剂配方
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3M Tris-acetate pH 7.0凝胶缓冲液(15X，100ml):
3M Tris-acetate pH 7.0凝胶缓冲液(15X，100ml):取36.33g Tris碱溶于90ml超纯水中。充分混匀并用醋酸调节PH值为7.0。定容至 100ml，4°C储存。
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LDS样品缓冲液(4X)
LDS样品缓冲液(4X):4ml2.5 M Tris-HCl PH 8.5，0.8g LDS，0.006g EDTA，5ml 80%甘油，0.75ml 1% CBB G250溶液，0.25ml 1%酚红溶液。充分混匀并储存在室温。
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40%丙烯酰胺溶液
40%丙烯酰胺溶液:37.5:1(丙烯酰胺/双丙烯酰胺混合)。4°C储存。
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APS:10%溶液。
APS:10%溶液
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TEMED:4°C储存
TEMED:4°C储存
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DTT(1，4-二硫苏糖醇):1ml水溶液，储存于-20°C
DTT(1，4-二硫苏糖醇):1ml水溶液，储存于-20°C
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跑胶缓冲液(1X)
跑胶缓冲液(1X):超纯水中溶解8.95g N-三(羟甲基)甲基甘氨酸，6.06g Tris碱，1g SDS，0.25g 亚硫酸氢钠，定容至1L。
此溶液PH值大约为8.24，4°C储存。 用超纯水(Milli-Q质量)和分析级试剂准备所有溶液。
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灌胶
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上图为如何使用梯度仪制备3‒15%梯度Tris-乙酸胶的示意图。
将3%和15%的聚丙烯酰胺溶液[由40%的丙烯酰胺(37.5:1丙烯酰胺/双丙烯酰胺混合物)储备溶液]同时分别倒入梯度仪的左右隔室中，梯度胶灌胶完成后，立即加入3%的溶液，然后使梯度凝胶凝固。