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对比
咨询Two-Step RT-PCR Kit两步法RT-PCR试剂盒具有高效合成能力和高扩增效率。该试剂盒能以动物、植物和微生物的总RNA或mRNA为模板，用2×1st Strand cDNA Synthesis SuperMix进行反转录，然后用2×HotStart Taq Master Mix进行扩增。本试剂盒含有从RNA到cDNA，以cDNA为模板进行扩增的全部试剂，本试剂盒RT 50次/PCR 200次。
产品特点:
操作简单：操作步骤少，降低污染。
特异性高：使用HotStart Taq酶进行扩增，减少非特异性反应。
产品组分：
组分名称 | 体积 |
2×1st Strand cDNA Synthesis SuperMix | 500ul |
2×HotStartTaq Master Mix | 1ml×2 |
RNase Free Water | 1ml |
实验方法：
第一链 cDNA 合成：
试剂融化后，将试剂盒中各组分混匀并稍微离心后置于冰上。
（1）按顺序加入以下反应物：
模板 RNA | 总RNA(0.1 ng -5μg) |
poly(A) mRNA(10 pg) | |
特异性 RNA(0.01 pg) | |
2×1st Strand cDNA Synthesis SuperMix | 10ul |
RNase Free Water | 至20ul |
可选步骤：如果 RNA 模板 GC 含量高或者含有二级结构，可先将RNA 模板和 RNase Free Water 混匀后，65°C 孵育 5 分钟（有助于打开高级结构，便于下一步反应的进行），迅速置于冰上冷却，再加入其它组分。
（2） 轻轻混匀，离心。
（3）42°C 孵育 15-30 分钟（如果 RNA 模板中不含 poly A 结构，25°C 先孵育 5 分钟，随后 42°C 孵育 15-30 分钟）。
（4）产物可直接用于下一步反应。如果不立即使用， 可于-20°C保存一周，长时间保存建议-70°C放置。
第一链 cDNA 的 PCR 扩增：
合成的第一链cDNA可直接用于PCR。
常用反应体系（20μl）：
2×HotStart Taq Master Mix | 10ul |
上游引物 | 0.2-1.0uM（终浓度） |
下游引物 | 0.2-1.0uM（终浓度） |
模板 | 1-2ul |
ddH2O | 至20ul |
常用 PCR 循环：
当扩增片段＜3K
94℃ | 5 分钟 |
30 次循环： | 94℃，20 秒 |
50-60℃，20 秒 | |
72℃，60 秒/kb | |
72℃ | 5 分钟 |
4℃ | 保温 |
当扩增片段≥3K（推荐引物长度≥30bp）
94℃ | 5 分钟 |
30 次循环： | 94℃，5 秒 |
68℃，60 秒/kb | |
72℃ | 5 分钟 |
4℃ | 保温 |
2、如果同时操作多个样品，建议先在冰上先配制预混液，然后再分装到各个反应管中，加入模板启动反应。
3、反应扩增时出现目标条带拖带，系模板浓度过高或特异引物浓度不适等原因所致，可对模板及引物浓度等进行调整；反应出现杂带，可对退火温度进行调整，或重新设计特异性高的引物。
4、为了保证反应的正常进行，需使用高质量的RNA模板。