今天是《抗体选择超全指南》专题的第三期，前两期我们介绍了《抗体选择超全指南之抗体小知识》和抗体选择基本原则《一文读懂抗体选择，建议收藏！》，今天就WB实验举例手把手教你选择合适的抗体，咱们开始吧~
案例一：WB检测原代人胰岛细胞siRNA敲降FKBP5后pAKTser473蛋白的表达情况
1、选择一抗
该一抗需满足三要素：
目的蛋白：内源性的磷酸化AKT（Ser473）
检测样本种属：人
实验方法：WB
依照我们在《一文读懂抗体选择，建议收藏！》中介绍的基本原则，以上这个抗体#4060无论是检测的靶标、实验方法、反应种属以及灵敏度都满足需求，并且这个抗体已发表文献10478篇，是非常经典热销的产品，所以就选择它了。
需注意的是，在检测磷酸化蛋白时，总蛋白和内参都需要做，因磷酸化水平的变化需要用磷酸化蛋白与总蛋白比值变化来判定，所以要同时购买AKT总蛋白的抗体，同理经过筛选后我们选择了#9272，以及内参beta-actin #abs119600。
一抗选择小心机：一抗尽量选择同一来源的，二抗可通用哦~
2、选择二抗
普通的WB实验，二抗可选择普通形式的，即名称包含anti-IgG(H+L)的，（还记得H+L代表什么意思吗?不记得的话可以去《抗体选择超全指南之抗体小知识》补课哦），这类产品适用性广且价格便宜。因#111-035-144稀释比例非常高，做WB最高可达1:200000，性价比高，所以优先选择了它。
3、选择结果
结果出炉，就是这么简单，你get到了吗？
| 选择目标 | 货号 | 来源 | 产品名称 |
| 磷酸化一抗 | 4060 | Rabbit | Phospho-Akt(Ser473)(D9E)XP® Rabbit mAb |
| 总蛋白一抗 | 9272 | Rabbit | Akt Antibody |
| 内参 | abs119600 | Rabbit | Rabbit anti-β-Actin Polyclonal Antibody |
| 二抗 | 111-035-003 | Goat | Peroxidase-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) |
案例二：荧光WB如何选择二抗
有小伙伴实验室做的是近红外荧光WB，那么应该如何选择抗体呢？其实荧光WB一抗的选择和普通WB没有区别，只是不再使用传统的HRP标记的二抗，而是使用近红外染料标记的二抗结合特异性一抗，无需使用胶片和显影液。
Alexa Fluor®680和Alexa Fluor®790都是近红外染料，除了这两种染料标记的二抗之外，很多厂家也推出其他的近红外染料标记二抗，若说明书写明适配了您的仪器平台，那么根据需求选择即可，以下是部分热卖的近红外染料标记二抗：
| 货号 | 种属来源/对应一抗种属 | 二抗形式 | 特异性 | 偶联标记 | 可消除交叉反应 | 规格 |
| 115-655-146 | Goat Anti-Mouse | Whole IgG | IgG (H+L) | Alexa Fluor® 790 | Human, Bovine, Horse, Rabbit, Swine Serum Proteins | 0.5 mg |
| 115-625-146 | Goat Anti-Mouse | Whole IgG | IgG (H+L) | Alexa Fluor® 680 | Human, Bovine, Horse, Rabbit, Swine Serum Proteins | 0.5 mg |
| 111-655-144 | Goat Anti-Rabbit | Whole IgG | IgG (H+L) | Alexa Fluor® 790 | Human, Mouse, Rat Serum Proteins | 0.5 mg |
| 111-625-144 | Goat Anti-Rabbit | Whole IgG | IgG (H+L) | Alexa Fluor® 680 | Human, Mouse, Rat Serum Proteins | 0.5 mg |
Alexa Fluor ® 790
Alexa Fluor ® 680
案例三：IP后的WB如何选择抗体
如果IP和WB一抗来源（Host/Source）相同，IP后沉淀含有目的蛋白和IP抗体，在高温金属浴及还原剂的作用下，IP抗体发生发生变性，断裂为游离的重链（~50kDa）和轻链（~25kDa） 。后续做WB若使用前述的常规Anti-IgG(H+L)的酶标二抗，会同时识别原先的IP抗体和WB抗体，导致膜上至少出现三条不同的带，那么如何解决这个问题呢？
解决方案一： WB一抗与IP一抗选择不同种属来源，此时选择普通二抗即可。
解决方案二： WB选用HRP偶联一抗，无需二抗。
解决方案三： 选用构象特异性或链型特异二抗，以避免重链和/或轻链的干扰。
构象特异性二抗，仅识别空间构象表位，高温变性的抗体失去了原有的空间构象，不会被识别，因此不会产生重链（~50kDa）和轻链（~25kDa）的条带。
当目标蛋白位于50kDa分子量附近时，可选择抗轻链的二抗，不识别重链，不会产生重链（~50kDa）的条带。
当目标蛋白位于25kDa分子量附近时，可选择抗重链端的二抗，不识别轻链，不会产生轻链（~25kDa）的条带。
部分相关产品如下：
| 货号 | 种属来源/对应一抗种属（标记） | 轻/重链特异性 |
| 93702 | Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (HRP Conjugate) | 抗轻链特异性，避免重链干扰 |
| 58802 | Rabbit Anti-Mouse IgG (Light Chain Specific) (D3V2A) mAb (HRP Conjugate) | 抗轻链特异性，避免重链干扰 |
| 115-035-008 | HRP-Goat Anti-Mouse IgG, Fcγ Secondary Antibody | 抗重链特异性，避免轻链干扰 |
| 111-035-008 | HRP-Goat Anti-Rabbit IgG, Fc Secondary Antibody | 抗重链特异性，避免轻链干扰 |
| 5127 | Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (HRP Conjugate) | 同时避免轻&重链干扰 |
注：文章内容来源于小优大学堂讲座《抗体选择最全指南》，点击此处观看讲座视频
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