Lipofectamine™ 3000

一、实验材料

1. 质粒DNA：0.5–5 μg/μL 储液，确保DNA纯度高、无降解，浓度符合要求。
2. Opti-MEM™ 减血清培养基：用于制备DNA-脂质体复合物，减少血清对转染过程的干扰。
3. 微量离心管：用于混合和孵育反应液。

二、实验时间

1. 制备时间：约10分钟，包括配制复合物等操作。
2. 孵育时间：10–15分钟，用于DNA与脂质体的结合。
3. 最终孵育时间：1–3天，根据实验需求和细胞类型确定细胞在转染后的培养时间。

三、重要指导原则

1. 复合物制备：在无血清培养基（如Opti-MEM™）中制备DNA-Lipofectamine™ 3000复合物，可直接加入含细胞培养基的细胞中，无论血清或抗生素是否存在。
2. 无需更换培养基：转染后无需去除转染复合物或更换/添加培养基，减少操作步骤，降低对细胞的影响。
3. 优化试剂用量：Lipofectamine™ 3000试剂用量需根据具体实验条件优化。建议测试推荐的两种浓度，以确定最佳用量，确保转染效率和细胞活性。

四、实验方案大纲

1. 细胞接种：将细胞接种于培养容器中，使其在转染时达到70–90%汇合度，确保细胞处于良好的生长状态，提高转染成功率。
2. 制备复合物：按照推荐的两种剂量制备质粒DNA-脂质体复合物，确保复合物的均匀性和稳定性。
3. 加入复合物：将制备好的DNA-脂质体复合物加入细胞中，开始转染过程。

五、实验步骤（以质粒DNA转染为例）

1. 细胞准备

• 在六孔板中每孔接种5×10⁵个细胞，培养至次日进行转染。
• 确保细胞生长良好，无污染，汇合度达到70–90%。

2. 配制无双抗培养基

• 配制不含抗生素的培养基，用于后续细胞培养和转染过程。

3. 换液与细胞处理

• 吸除六孔板中含双抗的培养基，用PBS冲洗两次，去除残留的双抗。
• 各孔加入1.75 mL无双抗培养基，将六孔板放入培养箱中，使细胞适应无双抗环境。

4. 制备复合物

• A组（Lipofectamine™ 3000组）：
  • 使用125 μL Opti-MEM™培养基稀释3.75 μL Lipofectamine™ 3000试剂，充分混匀。
• B组（DNA组）：
  • 使用125 μL Opti-MEM™培养基分别稀释2.5 μg质粒DNA（0.5–5 μg/μL）和5 μL P3000™试剂（2 μL/μg DNA），充分混匀。
  • NC组（阴性对照组）：使用2.5 μg对照质粒。
  • 实验组：使用2.5 μg目的质粒。

5. 混合与孵育

• 将A组和B组液体混合均匀，室温孵育10–15分钟，使DNA与脂质体充分结合，形成稳定的复合物。

6. 转染细胞

• 将上述混合好的质粒DNA-脂质体复合物（共250 μL）加入含有1.75 mL无双抗培养基的细胞孔中，轻轻晃动六孔板，使复合物均匀分布。

7. 后续处理

• 将六孔板放回培养箱中继续培养。
• 24小时后，根据实验需求分析转染细胞，进行下游实验，如荧光显微镜观察、流式细胞术检测或基因表达分析等。

六、注意事项

1. 无菌操作：整个实验过程需在无菌条件下进行，避免污染。
2. 细胞状态：确保细胞生长良好，无污染，汇合度合适，以提高转染效率。
3. 试剂保存：Lipofectamine™ 3000试剂需按照说明书要求保存，避免反复冻融。
4. 优化条件：根据细胞类型和实验需求，优化Lipofectamine™ 3000试剂和质粒DNA的用量，以获得最佳转染效果。
5. 下游实验：根据实验目的，选择合适的下游检测方法，如荧光显微镜观察、流式细胞术或基因表达分析等。

 

名称	货号	规格
Concentr. Anal. in BC 3000	BR200111	EA
QIAxcel DNA Fast Analysis Kit (3000)	929008	3000Test
Mouse anti-His Tag(HRP) Monoclonal Antibody	abs830011-50ul	50ul
His-Tag (27E8) Mouse mAb	2366T	20ul