The EF-Hand Protein CALML6 Suppresses Antiviral Innate Immunity by Impairing IRF3 Dimerization

一、引言

抗病毒天然免疫是机体抵御病毒感染的第一道防线，其有效激活对于控制病毒复制和传播至关重要。近年来，随着对天然免疫机制研究的不断深入，越来越多的负反馈调节机制被揭示，这些机制对于维持免疫稳态、防止过度免疫反应导致的组织损伤具有重要意义。本文将详细介绍中山大学附属肿瘤医院实验研究部陈帅课题组在《Cell Reports》上发表的题为“The EF-Hand Protein CALML6 Suppresses Antiviral Innate Immunity by Impairing IRF3 Dimerization”的研究论文，探讨CALML6蛋白在抗病毒天然免疫中的负反馈调节作用。

二、研究背景

（一）抗病毒天然免疫的重要性

病毒感染后，宿主细胞能够通过一系列模式识别受体（PRRs）识别病毒核酸，激活天然免疫信号通路，产生干扰素（IFN）等抗病毒因子，从而抑制病毒复制和传播。其中，I型干扰素（IFN-β）在抗病毒天然免疫中发挥着关键作用，其通过与细胞表面的干扰素受体结合，激活下游信号通路，诱导干扰素刺激基因（ISGs）的表达，进一步增强抗病毒效应。

（二）IRF3在抗病毒天然免疫中的作用

IRF3是干扰素调节因子家族成员之一，其在抗病毒天然免疫中扮演着核心角色。病毒感染后，IRF3能够被磷酸化并发生二聚体化，随后转移到细胞核内，与特定的DNA序列结合，促进IFN-β等抗病毒因子的转录。因此，IRF3的激活状态对于抗病毒天然免疫的启动和维持至关重要。

（三）CALML6蛋白的发现与功能

CALML6是EF-Hand蛋白家族中的一员，其含有EF-Hand结构域，能够与钙离子结合。然而，CALML6在天然免疫中的功能此前尚未被明确。本研究通过一系列实验，揭示了CALML6在抗病毒天然免疫中的负反馈调节作用，为理解天然免疫稳态的维持机制提供了新的视角。

三、研究方法与实验设计

（一）细胞培养与转染

研究者使用A549细胞系作为实验模型，通过CRISPR-Cas9技术敲除CALML6基因，获得CALML6敲除细胞株。同时，利用脂质体介导的转染方法，将CALML6过表达质粒转染到细胞中，以研究CALML6表达水平变化对细胞抗病毒能力的影响。

（二）病毒感染与IFN-β检测

将敲除或过表达CALML6的A549细胞分别感染VSV、SeV和HSV-1等病毒，通过ELISA方法检测细胞培养上清中IFN-β的表达水平。同时，利用实时荧光定量PCR（qPCR）技术检测细胞内Ifnb1 mRNA的表达水平，以评估CALML6对病毒诱导的IFN-β产生的影响。

（三）IRF3二聚体化与核转移检测

通过免疫共沉淀实验，检测CALML6与IRF3的相互作用。利用Western blot技术检测IRF3的磷酸化和二聚体化水平，以及其在细胞核和细胞质中的分布情况，以明确CALML6对IRF3激活状态的调控作用。

（四）转基因小鼠实验

构建人源CALML6转基因小鼠（TG小鼠），通过流式细胞术检测TG小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）中IFN-β的分泌水平。同时，利用qPCR技术检测TG小鼠肺、脾脏和肝脏等组织中Ifnb1 mRNA的表达水平，以评估CALML6在体内对IFN-β产生的影响。

四、研究结果与关键发现

（一）CALML6负反馈调节IFN-β信号

实验结果显示，与正常组相比，敲除CALML6蛋白的A549细胞在感染VSV、SeV和HSV-1后，IFN-β的表达量显著降低。这表明CALML6在细胞内能够负反馈调节IFN-β信号，抑制过度的抗病毒反应。

（二）CALML6与IRF3的相互作用

通过免疫共沉淀实验，研究者发现CALML6能够直接与IRF3的磷酸化SR区域结合。这种结合破坏了IRF3的二聚体化和核转移，从而抑制了IRF3的激活。进一步的实验表明，CALML6的表达水平与IRF3的激活状态呈负相关，即CALML6表达越高，IRF3的激活程度越低。

（三）转基因CALML6小鼠的表型

在转基因小鼠实验中，研究者发现TG小鼠的BMDMs在感染VSV后，分泌的IFN-β量显著低于野生型（WT）小鼠。同时，TG小鼠血清中的IFN-β水平也低于WT小鼠。此外，TG小鼠肺、脾脏和肝脏等组织中Ifnb1 mRNA的表达水平明显降低。这些结果表明，CALML6在体内能够抑制IFN-β的产生，从而影响抗病毒天然免疫反应。

（四）CALML6对病毒复制的影响

研究还发现，CALML6的表达能够促进病毒的复制。在CALML6过表达的细胞中，病毒的复制量显著增加，而敲除CALML6则能够抑制病毒的复制。这进一步证实了CALML6通过负反馈调节IFN-β信号，影响抗病毒天然免疫反应，从而影响病毒的复制和传播。

五、研究意义与展望

（一）揭示CALML6在抗病毒天然免疫中的负反馈调节作用

本研究首次揭示了CALML6在抗病毒天然免疫中的负反馈调节作用，明确了其通过与IRF3相互作用，抑制IRF3的二聚体化和核转移，从而抑制IFN-β的产生。这一发现丰富了我们对天然免疫负反馈调节机制的认识，为理解天然免疫稳态的维持提供了新的视角。

（二）为病毒感染和自身免疫性疾病的治疗提供新靶点

CALML6作为一种负反馈调节因子，其在抗病毒天然免疫中的作用为病毒感染和自身免疫性疾病的治疗提供了新的潜在靶点。通过调节CALML6的表达或活性，可能有效控制过度的免疫反应，防止组织损伤，同时增强抗病毒能力。

（三）促进对EF-Hand蛋白家族功能的进一步研究

CALML6是EF-Hand蛋白家族中的一员，其在天然免疫中的功能揭示为研究EF-Hand蛋白家族其他成员的功能提供了新的思路。未来的研究可以进一步探索EF-Hand蛋白家族在天然免疫和其他生理病理过程中的作用，为开发新的治疗策略提供理论依据。

六、结论

综上所述，本研究通过揭示CALML6在抗病毒天然免疫中的负反馈调节作用，为理解天然免疫稳态的维持机制提供了新的见解。CALML6通过与IRF3相互作用，抑制IRF3的二聚体化和核转移，从而抑制IFN-β的产生，影响抗病毒天然免疫反应。这一发现不仅丰富了我们对天然免疫调节机制的认识，还为病毒感染和自身免疫性疾病的治疗提供了新的潜在靶点。未来的研究将进一步探索CALML6在其他生理病理过程中的作用，为开发新的治疗策略提供更多的科学依据。

名称	货号	规格
Rabbit anti-VSV-g Tag Polyclonal Antibody	abs113348-50ul	50ul
Phospho-IRF-3 (Ser396) (D6O1M) Rabbit mAb	29047T	20μl
Phospho-IRF-3 (Ser396) (D6O1M) Rabbit mAb	29047S	100ul
Rabbit anti-TRIM32 Polyclonal Antibody	abs137045-50ug	50ug

文献解析|EF-Hand蛋白家族中的关键成员：CALML6在抗病毒天然免疫中的作用