石蜡切片免疫组化（IHC-P）技术详解

石蜡切片免疫组化（IHC-P）

IHC-P技术详解

1. 样本准备：选取新鲜组织样本，固定于10%中性福尔马林溶液中，固定时间一般为24-48小时。固定后的组织需进行脱水、透明、石蜡包埋等处理，最后制成4-6μm厚的切片。
2. 切片：使用切片机将石蜡块切成4-6μm厚的切片，切片需完整、无裂纹，厚度均匀。
3. 脱蜡与水化：将切片置于二甲苯中脱蜡，随后逐级酒精水化至PBS缓冲液中。
4. 抗原修复：根据抗原的性质选择合适的抗原修复方法，如高压修复、微波修复或酶修复等。抗原修复的目的是恢复被固定过程中掩盖的抗原表位，提高抗体的结合率。
5. 封闭：用封闭液（如正常血清或BSA）孵育切片，以减少非特异性结合。封闭时间一般为30分钟，温度为室温或37℃。
6. 抗体孵育：加入一抗（如针对目标抗原的特异性抗体），在4℃孵育过夜或室温孵育1-2小时。一抗的选择需根据目标抗原的特性和实验需求进行筛选。
7. 洗涤：用PBS或TBS缓冲液洗涤切片，去除未结合的一抗。
8. 二抗孵育：加入与一抗对应的二抗（如HRP或荧光标记的二抗），在室温下孵育30分钟至1小时。
9. 洗涤：再次用PBS或TBS缓冲液洗涤切片，去除未结合的二抗。
10. 显色与观察：对于HRP标记的二抗，可加入DAB底物进行显色反应；对于荧光标记的二抗，可直接在荧光显微镜下观察。显色反应需在适宜的条件下进行，以确保信号的清晰和稳定。
11. 封片与保存：用封片剂封片后，可在光学显微镜或荧光显微镜下观察并拍照记录结果。封片后的切片需妥善保存，避免光照和潮湿环境。

• 组织保存：石蜡切片能够较好地保存组织结构和抗原性，适用于长期保存和多次染色。
• 切片质量：石蜡切片的厚度均匀，切片质量较高，适合高分辨率显微镜观察。
• 应用广泛：IHC-P可应用于多种组织类型和抗原检测，具有广泛的应用前景。

• 抗原修复：某些抗原在固定过程中可能被掩盖，需要进行抗原修复，增加了实验的复杂性。
• 操作时间：石蜡切片的制备过程较为繁琐，耗时较长，不适合快速诊断。
• 背景染色：由于石蜡切片的非特异性结合较高，可能导致背景染色增加，影响结果的准确性。