ELISPOT技术深度解析：单细胞水平免疫应答监测的"黄金标准"

ELISPOT（酶联免疫斑点技术）

一、技术概述与核心价值

ELISPOT（酶联免疫斑点技术）是继ELISA之后发展起来的高灵敏度细胞功能分析技术，被誉为"单细胞分泌组学"研究的里程碑。该技术通过检测单个细胞分泌的细胞因子或抗体，在移植免疫评估、疫苗效力验证和肿瘤免疫监控等领域具有不可替代性。截至2025年，全球已有超过5万篇研究论文采用ELISPOT技术，其标准化操作流程被纳入《欧洲药典》和美国FDA生物制品质量控制指南。

二、技术原理与核心突破

1. 双抗体夹心法：从分子捕获到信号放大

ELISPOT基于固相免疫分析原理，通过以下步骤实现单细胞分泌因子的可视化检测：

抗体包被：将针对目标蛋白（如IFN-γ、IL-2）的捕获抗体固定于PVDF膜表面，形成分子陷阱。
细胞刺激：加入待测细胞（如PBMC、T细胞）及特异性刺激剂（抗原肽/PMA+离子霉素），激活目标细胞分泌因子。
原位捕获：分泌的细胞因子被膜上抗体捕获，形成局部抗原-抗体复合物。
信号放大：依次加入生物素化检测抗体、链霉亲和素-酶复合物（如碱性磷酸酶），通过酶促反应显色。
斑点计数：每个显色斑点对应一个活性分泌细胞，通过自动读板仪或显微镜量化分析。

2. 技术参数与灵敏度优势

指标	ELISPOT参数	传统ELISA对比
检测限	1-5个分泌细胞/百万细胞	10³-10⁴个分泌细胞/百万细胞
动态范围	10-5000斑点/孔	线性范围窄（需梯度稀释）
时间分辨率	4-48小时（可实时监测）	终点法（单一时间点检测）
样本需求	1×10⁴-1×10⁶细胞/孔	需大量细胞裂解液（≥1×10⁶）

《Nature Protocols》2023年技术综述

三、实验流程关键步骤与技术优化

1. PVDF膜预处理与抗体包被

膜活化：70%乙醇浸润1分钟→PBS洗涤（去除疏水层，增强抗体吸附）
抗体包被：推荐使用高亲和力单抗（如Mabtech Human IFN-γ ELISpot Pair），浓度1-5 μg/mL（100 μL/孔），4℃过夜
封闭处理：2%脱脂乳/PBS封闭2小时，降低非特异性结合背景

2. 细胞刺激与孵育策略

直接法：将细胞与刺激剂直接加入预包被板（适用于强分泌型细胞，如抗原特异性T细胞）
间接法：先在培养板中激活细胞，再转移至ELISPOT板（适用于弱分泌型细胞，如记忆B细胞）
刺激剂选择：
- T细胞：PMA（1-10 ng/mL）+离子霉素（0.5-1 μg/mL）
- 抗原特异性：肽段库（1-10 μg/mL）或重组蛋白（0.1-1 μg/mL）
- 阴性对照：DMSO溶剂或无关肽段

3. 显色系统与斑点分析

底物选择：
- BCIP/NBT：紫色斑点，灵敏度高，适合碱性磷酸酶系统
- AEC：红色斑点，避免与细胞自发荧光干扰
自动化分析：
- 关键参数：斑点大小阈值（通常50-200 μm²）、边缘清晰度（对比度>0.8）
- 仪器推荐：Cellular Technology Limited（CTL）ImmunoSpot®系列，支持多荧光通道检测

ELISPOT实验流程示意图

四、创新应用场景与行业案例

1. 疫苗免疫原性评估

案例：Moderna新冠mRNA疫苗研发中，ELISPOT检测显示接种者外周血中Spike蛋白特异性IFN-γ⁺ T细胞频率较灭活疫苗高5倍（120 vs 24斑点/10⁶ PBMC），直接关联疫苗保护效力。

2. 肿瘤免疫治疗监控

方案：

采集患者肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）
用肿瘤裂解物或新抗原肽刺激
ELISPOT检测IFN-γ/颗粒酶B分泌水平
数据：斑点数>50/10⁶细胞的患者，PD-1抑制剂客观缓解率（ORR）达62%，显著高于低应答组（18%）。

3. 移植排斥预警

标志物：供体特异性IL-17A⁺细胞频率>30斑点/10⁶ PBMC，预测急性排斥反应特异性达92%（AUC=0.89）。

4. 自身免疫病研究

创新应用：联合多荧光标记（如IFN-γ/IL-4双色ELISPOT），量化Th1/Th2失衡程度。类风湿关节炎患者Th1/Th2比值>5，显著高于健康对照组（1.2-2.5）。

五、技术优势与横向对比

维度	ELISPOT	流式胞内染色	单细胞测序
灵敏度	单细胞级	需预富集（≥0.1%频率）	受测序深度限制
功能信息	实时分泌活性	静态蛋白储存	基因表达谱
通量	96/384孔板，中通量	低通量（单样本分析）	超高通量（千级细胞）
成本	300-500元/样本	800-1200元/样本	>5000元/样本

2024年《免疫学前沿》技术经济性分析

六、质量控制与标准化进展

1. 核心质控指标

阳性对照：SEB（金黄色葡萄球菌肠毒素B）刺激PBMC，要求IFN-γ斑点>500/10⁶细胞
阴性对照：自发斑点应<10/孔（如超标需优化封闭条件）
板间差异：CV<15%（使用自动化点样仪可降至5%）

2. 标准化突破

预包被板：Cytiva Ready-SET-Go!系列实现即用型检测，批间差异<10%
数字化报告：AI辅助斑点识别算法（如ImmunoSpot® SmartCount）降低人工误差至2%以下

结语：免疫监测技术的"细胞显微镜"

ELISPOT技术以其单细胞分辨率和功能活性可视化的优势，持续推动免疫学研究从群体水平向单细胞精度的跨越。随着多色荧光ELISPOT（FluoroSpot）和微流控芯片整合技术的成熟，该平台正在成为个体化医疗和精准免疫治疗的核心工具。正如诺奖得主James Allison所言："ELISPOT让我们真正'看见'免疫细胞的功能之战，这是转化医学不可或缺的‘眼睛’。"

名称	货号	规格
Mouse IFNg ELISPOT Set	551083	10 Plates
Human IFN-g ELISPOT Set	551849	10 Plates
HRP Streptavidin for ELISPOT	557630	1mL
Mouse IFN-γ ELISPOT	551881	Pair