7-Dehydrocholesterol dictates ferroptosis sensitivity
铁死亡的特征在于铁依赖的磷脂过氧化过程，该过程最终导致生物膜的破坏。当前研究揭示，细胞抵御铁死亡的防御机制主要包括以下三种：①解毒机制，其中GSH-谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）能够将磷脂过氧化物转化为磷脂醇，从而实现解毒；②自由基捕获机制，涉及铁死亡抑制蛋白1（FSP1）与辅酶Q10（CoQ10）等分子的作用；③MBOAT1/2介导的细胞磷脂重构机制。
7-脱氢胆固醇（7-DHC）是远端胆固醇生物合成途径中的一个关键中间产物，它可通过7-脱氢胆固醇还原酶（DHCR7）进一步转化为胆固醇。7-DHC作为一种不饱和甾醇，其B环上含有5,7-二烯结构，因此具有作为脂肪酸过氧自由基H原子供体的潜力。
基于上述背景，王平教授团队提出假设：7-DHC可能通过保护细胞免受磷脂过氧化的作用，从而抑制铁死亡。本研究将围绕这一假设，深入探讨远端胆固醇生物合成途径对铁死亡的影响。
远端胆固醇合成调控铁死亡
研究利用人胚肾细胞系HEK293T进行了全基因组CRISPR-Cas9筛查。通过将靶向18,543个基因的全基因组sgRNA文库导入HEK293T细胞，并使用GPX4抑制剂RSL3进行处理，成功鉴定了数个已知的铁死亡抑制因子，包括SLC7A1、FSP1和GCH1，这验证了筛查的有效性。值得注意的是，多个参与远端胆固醇生物合成的基因也被鉴定为铁死亡抑制因子，如固醇C5-去饱和酶SC5D、MSMO1、CYP51A1和EBP。
进一步的分析揭示，远端胆固醇生物合成基因可能具有抵抗铁死亡的功能。利用STRING和Gene Ontology（GO）对筛查数据进行富集分析，发现胆固醇合成基因在排名中占据前列。同时，对癌症治疗疗效数据库（CTRP）的分析显示，胆固醇合成基因SC5D、CYP51A1、MSMO1和EBP的表达与抵抗铁死亡的诱导之间存在正相关关系。
在HEK293T细胞中，敲除远端胆固醇生物合成基因SC5D、CYP51A1、MSMO1或EBP后，细胞对铁死亡的诱导变得更加敏感。而重新表达SC5D可以缓解这种敏感性。此外，促铁蛋白基因ACSL4负责将多不饱和脂肪酸转移至磷脂上，若敲除ACSL4基因，则即使敲除SC5D也无法有效诱导铁死亡。
在全基因组筛选中，促铁蛋白排名首位的是DHCR7，该基因可将7-DHC转化为胆固醇。DHCR7的排名甚至高于已知的铁死亡介质，如ACSL4等。若敲除DHCR7，则细胞无法被诱导产生铁死亡。
胆固醇本身并不直接影响铁死亡。单独敲除远端胆固醇生物合成基因对细胞的胆固醇水平影响较小。此外，向细胞培养基中直接添加胆固醇并不会诱导铁死亡，细胞活性几乎不受影响。
目前，远端胆固醇生物合成途径对铁死亡的抑制机制尚不清楚。敲除远端胆固醇生物合成基因SC5D或DHCR7并不会影响已知的铁死亡调节因子，如GPX4、FSP1、DHODH、SLC7A11和ACSL4的蛋白水平，同时GSH、Fe2+以及抗铁死亡代谢产物CoQ10和角鲨烯的水平也无明显变化。
7-DHC对铁死亡的抑制作用研究
在远端胆固醇生物合成途径中，究竟哪一个分子对铁死亡产生关键影响？为探究此问题，本研究进行了系列基因敲除实验。
当敲除下游的DHCR7基因时，7-DHC向胆固醇的生物转化过程受阻，导致7-DHC在体内不断积累。而分别单独敲除上游的SC5D、CYP51A1、MSMO1或EBP基因，则会导致7-DHC的产生减少。基于这一现象，我们推测7-DHC的积累可能具有抑制细胞铁死亡的作用。
为验证这一推测，本研究进行了上下游双敲除细胞实验。通过同时敲除7-DHC合成的直接上游酶SC5D和下游酶DHCR7，我们发现仅敲除DHCR7（导致7-DHC积累）时，细胞对铁死亡的诱导变得不易敏感。然而，当同时敲除SC5D（减少7-DHC产生）和DHCR7时，细胞对铁死亡的诱导变得更加敏感。这一结果支持了7-DHC积累能够抑制铁死亡的假设。
进一步研究表明，在远端胆固醇合成过程中，7-DHC的积累是影响铁死亡的关键过程。使用DHCR7选择性抑制剂AY9944处理野生型细胞，可以提高细胞内7-DHC的水平，并显著抑制铁死亡。然而，在敲除SC5D的细胞中，AY9944无法产生此效应。
为探究7-DHC抑制铁死亡的普遍性，本研究通过直接补充7-DHC或利用环糊精衍生物载体MβCD包被将7-DHC输送至细胞中，以及使用DHCR7抑制剂AY9944抑制7-DHC的转化，均可增加细胞内7-DHC的水平。在多种铁死亡诱导剂处理的情况下，这些方法均可抑制多种类型肿瘤细胞的铁死亡。相比之下，其他胆固醇生物合成途径的中间产物，如羊毛甾醇（CYP51A1的底物）、T-MAS（MSMO1的底物）、Zymstenol（EBP的底物）和7-烯胆烷醇（SC5D的底物），对细胞铁死亡无显著影响。
综上所述，7-DHC是一种强效的铁死亡抑制因子，细胞内7-DHC的积累能够抑制铁死亡的发生。
7-DHC对铁死亡的抑制作用
已有实验证据表明，远端胆固醇生物合成中间产物7-脱氢胆固醇（7-DHC）能够抑制细胞铁死亡。那么，7-DHC究竟通过何种分子机制来发挥这一抑制作用呢？
7-DHC的积累可有效减少脂质过氧化，包括线粒体膜上的脂质过氧化。磷脂过氧化是铁死亡的一个标志性特征，本研究采用BODIPY 581/591 C11探针来监测这一过程。当用7-DHC处理HEK293T和HT1080细胞时，可明显阻断铁死亡诱导剂RSL3所介导的脂质过氧化反应。此外，敲除DHCR7基因会导致细胞内源性7-DHC的积累，进而减少脂质过氧化；而敲除MSMO1、CYP51A1、EBP或SC5D基因后，则会导致细胞内源性7-DHC的缺乏，从而促进脂质过氧化。
在诱导细胞铁死亡后，细胞内的7-DHC水平明显降低，而其氧化产物DHCEO的水平则增高。这表明在铁死亡过程中，7-DHC会发生氧化而减少，无法持续存在以抵抗铁死亡。
那么，7-DHC抑制脂质过氧化的分子化学机制是什么呢？7-DHC是一种不饱和甾醇，其B环上含有5,7-二烯结构。通过模拟对比7-DHC与麦角固醇、豆固醇和胆固醇，发现只有7-DHC和麦角固醇能够明显抑制磷脂的自氧化，且它们的结构中均含有5,7-二烯，可作为酯类提供H原子。
铁死亡的驱动主要依赖于膜磷脂中的多不饱和脂肪酸氧化，而非游离的多不饱和脂肪酸氧化。因此，7-DHC很可能能够抑制线粒体膜和细胞膜的磷脂过氧化。事实上，确实在线粒体膜和细胞膜上检测到了7-DHC的存在。当敲除DHCR7基因后，膜上的7-DHC大量积累，检出量显著增加。
令人意外的是，在线粒体膜和细胞膜上都检测到了DHCR7的存在。在铁死亡过程中，脂质发生过氧化，DHCR7的第380位半胱氨酸可被亲电子的中间产物羰基化，这种羰基化可以激活DHCR7。
本研究利用AlphaFold2预测了人源DHCR7与嗜碱甲烷菌的δ14-甾醇还原酶的结构，并进行比对。结果发现，DHCR7的第380位半胱氨酸位于其NADPH结合口袋附近，提示该位点的修饰可能影响NADPH的结合亲和力，进而影响DHCR7的催化活性。
7-DHC与肿瘤铁死亡的研究
诱导肿瘤细胞铁死亡是治疗肿瘤的重要途径之一。若通过药物抑制7-DHC，使肿瘤细胞更易发生铁死亡，是否可作为治疗肿瘤的新方法？
本研究选用了TASIN-30，该药物为7-DHC上游合成酶EBP的特异性抑制剂。经TASIN-30处理后，肿瘤细胞的7-DHC水平降低，多种肿瘤细胞变得更易诱发铁死亡。当敲除肿瘤细胞的EBP或DHCR7基因后，TASIN-30的处理效果消失，这表明TASIN-30确实是通过抑制7-DHC的合成途径来发挥抑癌作用的。
进一步研究发现，某些类型的肿瘤细胞对7-DHC具有高度的依赖性。通过Project Score数据库筛选，本研究确定了42种肿瘤细胞系，其存活在很大程度上依赖于SC5D合成的7-DHC。其中，人弥漫大B淋巴瘤细胞系SU-DHL-8对7-DHC的依赖程度最高，细胞内7-DHC水平约为110 ng/百万个细胞。
值得注意的是，仅使用TASIN-30阻断7-DHC的合成，即使不额外给予任何铁死亡诱导剂，也能显著诱导SU-DHL-8细胞发生铁死亡。这表明内源性的7-DHC具有抑制SU-DHL-8细胞铁死亡的作用。
为了构建临床前肿瘤动物模型，本研究将SU-DHL-8细胞移植至小鼠体内，并注射TASIN-30。结果显示，肿瘤组织的7-DHC水平显著降低，肿瘤生长明显减缓，而对小鼠的体重无明显影响。当联合注射TASIN-30和铁死亡抑制剂liproxstatin-1时，TASIN-30的抑瘤作用消失，这表明TASIN-30的抑瘤作用依赖于激活肿瘤细胞的铁死亡。通过检测脂质过氧化产物四羟基壬烯（4-HNE），进一步证实了TASIN-30能够诱导肿瘤细胞的铁死亡。
综上所述，通过药物抑制7-DHC的生物合成，可诱发肿瘤细胞的铁死亡，这是一种有效的癌症治疗策略，尤其对于那些7-DHC水平较高的肿瘤更具疗效。
7-DHC在预防肾缺血再灌注损伤中的作用
缺血再灌注损伤导致的细胞死亡主要以铁死亡的形式出现。那么，通过提高机体7-DHC水平，是否能够有效预防肾的缺血再灌注损伤呢？
由于无法直接向机体注射7-DHC，本研究选择了靶向7-DHC下游酶DHCR7的策略，以期提高机体内的7-DHC水平。在小鼠实验中，通过预注射DHCR7抑制剂AY9944，成功促进了7-DHC在小鼠血清和肾脏内的积累。这一处理有效抑制了肾组织细胞的铁死亡，显著减弱了肾的缺血再灌注损伤。实验结果显示，血尿素氮和肌酐水平更低，组织切片也进一步证实了这一保护效果。
综上所述，提高机体内源性7-DHC的积累，可以有效抑制细胞铁死亡，从而保护重要器官免受缺血再灌注损伤的影响。
| 名称 | 货号 | 规格 |
| AMID (B-6) | sc-377120 | 200μg/ml |
| DHODH (E-8) | sc-166348 | 200μg/ml |
| InVivoMAb anti-mouse NK1.1 | BE0036-1MG | 1MG |
| BODIPY 581/591 C11（脂质过氧化传感器） | D3861 | 1MG |
