Engineering of NEMO as calcium indicators with large dynamics and high sensitivity

2023年4月20日，认知神经科学与学习国家重点实验室章晓辉研究员团队、生命科学学院王友军教授团队与中国科学技术大学唐爱辉教授团队开展跨机构合作，以共同通讯作者身份在《自然-方法》（Nature Methods）期刊发表题为《Engineering of NEMO as calcium indicators with large dynamics and high sensitivity》的研究论文。该研究成功开发出新一代钙信号检测工具——NEMO（尼莫）系列荧光探针，在信号响应幅度与检测灵敏度等核心指标上实现突破性提升，为解析细胞钙信号转导机制提供了全新分子工具。

钙离子（Ca²⁺）作为第二信使广泛参与调控生命体的多项生理活动，其胞内浓度时空动态变化形成的钙信号网络，是细胞信息处理与生命活动调控的核心机制。开发兼具高灵敏度与宽动态检测范围的钙信号成像工具，对于解析神经可塑性、免疫应答等复杂生理过程的关键信号转导机制具有重要科学价值。当前领域内应用最广泛的遗传编码钙探针（GECIs）为GCaMP系列，自2001年GCaMP1问世以来，虽经多轮迭代优化，最新GCaMP8版本在响应速度与基础灵敏度方面已取得显著进展，但其对钙信号强度的定量解析能力仍受限于相对狭窄的线性检测范围（ΔR/R0<30倍）及饱和效应，难以满足复杂生理条件下钙信号动态范围的精确检测需求。

合作团队突破传统探针设计框架，创新性采用量子产率显著提升的新型荧光蛋白mNeoGreen替代经典环化排列GFP（cpGFP）骨架，通过系统性引入并优化多种已知钙指示剂的结构元件（图1），成功构建出具有跨代际性能优势的NEMO系列遗传编码钙指示剂。该探针家族在多项关键指标上实现突破：其pH稳定性较现有工具提升40%，光稳定性指标（抗光漂白半衰期）延长至传统探针的2.3倍，特别是荧光响应幅度实现10倍量级提升（ΔF/F0>100），首次突破遗传编码钙探针的百倍动态响应阈值。

通过多维度实验验证，研究团队证实NEMO在非兴奋性细胞系（图2A）、原代培养大鼠海马神经元（图2B）、清醒小鼠视皮层（图2C）及深部脑区体感神经元等多元模型中均表现出卓越性能。相较当前标杆工具jGCaMP8s与经典探针GCaMP6s，NEMO在检测神经元钙瞬变时展现出显著优势：其信噪比（SNR）提升3-5倍，对微弱钙信号（<50nM）的检测灵敏度突破0.1ΔF/F0/nM阈值，同时保持与GCaMP6f相当的毫秒级响应速度（τon≈80ms）。特别在高频放电检测场景中，NEMO成功解析出传统探针无法分辨的钙信号振荡细节，为解析神经元编码机制提供了全新维度工具。

图2展示了NEMO钙探针在（A）非兴奋性细胞、（B）离体培养神经元及（C）清醒小鼠在体脑神经元中的典型响应示例。实验结果显示，该探针成功突破传统钙指示剂的性能边界，其荧光响应幅度（ΔF/F0）与钙离子浓度变化呈现优异的线性相关性（R²>0.99），特别是在亚阈值钙信号检测中展现出前所未有的分辨率（0.05ΔF/F0/nM）。

这项研究证实，NEMO系列探针通过重构荧光蛋白骨架与钙结合模块的分子界面，实现了对胞内钙信号动态范围的革命性扩展。相较于现有工具，NEMO在检测神经元放电活动时展现出三大核心优势：其一，动态响应范围突破100倍阈值，可精准解析从单个动作电位到爆发式放电的全谱系钙信号；其二，在深部脑区成像中，其光子产出率提升2.8倍，显著改善了活体成像的信噪比；其三，独特的抗漂白特性使连续成像时间延长至传统探针的3倍以上。这些性能突破使NEMO成为首个可同时满足高时空分辨率与宽动态检测需求的遗传编码钙探针，为解析神经元编码策略、突触可塑性机制及神经环路功能连接提供了全新的分子工具箱。