1、样品和缓冲液怎样选择和处理？
（1）缓冲液和样品组成是实现高分辨率的重要因素。蛋白质的性质（如电荷基团数量、疏水性和大小）会影响分子筛的分离。通常使用pH值在6.0-8.0之间的缓冲液，大部分蛋白质在该pH范围内是稳定的，可以优先尝试50 mM磷酸盐、150 mM氯化钠（pH值为7.0）的缓冲液。选择缓冲液PH时应尽量避开蛋白等电点，防止蛋白沉聚。
（2）此外，选择对目标蛋白质有益的离子强度也很重要。适当添加Nacl可减少非特异性结合，离子强度过高可能会增加填料和蛋白质之间的疏水相互作用，从而影响峰面积和分离度。
（3）使用高质量的水和化学试剂。溶液使用前应通过0.45 μm或0.22 μm滤膜过滤和脱气。
（4）缓冲液和色谱柱在使用前必须具有相同的温度。温度的快速变化，例如从冷藏室中取出的层析柱在室温下使用缓冲液，会在柱床中引入气泡，从而导致分离效果不佳。
（5）样品必须澄清且无颗粒物。对于小体积样品，可选用醋酸纤维素，再生纤维素或聚偏二氟乙烯材质的针头式滤器进行过滤，微量样品可采用高速离心的方法去除样品中不溶物。
常用蛋白纯化专用针头滤器货号：
0.45um滤膜
| 货号 | 名称 | 上样量 |
| 4604 | Acrodisc 13mm SUPOR .45um gam 75pk | 小于10ml |
| 4614 | Acrodisc 25mm SUPOR .45um gam 50pk | 小于100ml |
| 4654 | Acrodisc 32mm SUPOR .45um gam 50pk | 100ml-300ml |
0.2um滤膜
| 货号 | 名称 | 上样量 |
| 4602 | Acrodisc 13mm SUPOR .2um gam 75pk | 小于10ml |
| 4612 | Acrodisc 25mm SUPOR .2um gam 50pk | 小于100ml |
| 4652 | Acrodisc 32mm SUPOR .2um gam 50pk | 100ml-300ml |
2、样品和缓冲液的粘度是否有影响？
（1）对于高粘度溶液和低温溶液，请使用较低的运行流速。当运行高粘性样品（例如含有甘油的样品）时，如果在上样期间压力增加，则可能需要稀释样品或降低流速。粘度随温度而变化。如果样品与所用缓冲液的粘度相差不超过1.5倍，通常不会影响分离。
（2）如果样品的粘度非常高，则可以通过增加洗脱液的粘度来补偿，例如添加蔗糖或葡聚糖。
（3）液体的粘度随着盐浓度的增加而增加。混合有机溶液也会影响粘度，例如50%乙醇溶液的粘度远高于纯水和100%乙醇。
3、层析柱如何进行清洁？
定期清洁层析柱（例如每运行3-5次后）将延长其寿命，并有助于实现层析柱的最佳性能。
清洁可去除可能积聚在色谱柱上的任何沉淀蛋白质或其他污染物。除了常规清洁外，如果在柱床顶部看到变色或背压大幅增加，也应该清洗层析柱。
SEC层析柱对高pH具有良好的耐受，可以用NaOH多次清洗。NaOH的浓度取决于填料类型：Superose和Superdex色谱柱使用0.5 M NaOH，而Sephacryl层析柱仅使用0.2 M NaOH。
分子筛短期和长期保存方法及再生步骤可查看：分子筛短期和长期保存方法及再生步骤
4、层析柱如何换滤膜？
层析柱堵塞的原因也可能是滤膜堵塞，此时需要更换滤膜。
更换滤膜视频：
（1）Superdex/Superose Increase顶膜更换：https://www.univ-bio.com/article/id-4655.html
（2）Superdex/Superose Increase底膜更换：https://www.univ-bio.com/article/id-4654.html
（3）Hiload Superdex拆柱膜：https://www.univ-bio.com/article/id-4656.html
（4）Hiload Superdex换柱膜：https://www.univ-bio.com/article/id-4657.html
常用滤膜货号：
Superdex/Superose Increase
| 货号 | 名称 | 层析柱柱型 |
| 29053612 | TRICORN 10 Filter Kit | 10/300 |
| 29053586 | TRICORN 5 Filter Kit | 5/150 |
Hiload Superdex
支撑网
| 货号 | 名称 | 层析柱柱型 |
| 19065101 | SUPPORT SCREEN | 16/600 |
| 18937701 | SUPPORT SCREEN | 26/600 |
筛网
| 货号 | 名称 | 层析柱柱型 |
| 18876101 | NET RING XK 16(10UM), PKG/5 | 16/600 |
| 18876001 | NET RING XK 26(10UM), PKG/5 | 26/600 |
5、层析柱使用后应该保存在什么buffer中？
短期可保存在缓冲液中，如果超过2天不使用层析柱时，储存在20%乙醇中。
层析柱保存需添加储液装置（shipping device），储液装置操作请查看：https://www.univ-bio.com/article/id-4846.html。
6、层析柱进气了怎么办？
少量进气通常不会影响层析柱的性能。可用脱气缓冲液低流速下反向冲洗层析柱来去除小气泡。
如何防止层析柱进气：
（1）确保缓冲液、系统和层析柱都具有相同的温度，尤其是缓冲液已储存在冰箱或冷藏室中时。
（2）将层析柱连接到系统时，确保系统的所有部件（包括管路）都充满液体，以防止空气进入系统。
（3）保持缓冲液在运行时一直有液体。
（4）连接层析柱时使用液滴对液滴的方式。
7、Cytiva的Superdex Increase和Superose Increase系列预装柱能否安装在HPLC上？
Cytiva的Superdex Increase和Superose Increase层析柱可以使用标准的1/16接头接入传统HPLC系统，用于分析目的，例如质量控制。
初次使用建议先以较低的流速运行，防止超压，后续可根据层析柱的压力情况调整运行流速。
8、凝胶过滤层析样品出峰位置正常，峰出现拖尾或者前倾？
正常峰通常是左右比较对称的，但是实际实验中有可能出现拖尾或者前伸，如下图所示。
（1）出现峰拖尾的主要原因和解决方法
（2）出现峰前倾的主要原因和解决方法：
9、层析柱塌陷或者顶端出现空柱如何处理？
对于Increase这种预装柱来说，如果柱头和填料之间出现缝隙（如下图所示），通常原因是柱床发生过超压，导致部分填料挤压变形 ，这种情况对于胶粒的损伤是不可逆的。出现缝隙后对于柱效的影响较大。
处理方法：
（1）出现这种情况应立即停止流速，把层析柱从仪器上取下来；
（2）如果超压时间不长，填料可能会反弹恢复，此时用去离子水反向冲洗柱子；然后再正向冲洗柱子，如果此时胶面下降，则调节柱头至胶面；
（3）如果填料没有恢复，调节柱头至胶面后，再反向清洗；
（4）如果柱子塌陷过多，建议更换分子筛；
注意：柱子塌陷的原因很大可能是柱子发生堵塞，处理之后应尽快清洁柱子。
10、柱子超压如何处理？
首先应该明确超压是层析柱引起的，还是层析系统引起的。
（1）可以通过将层析柱取下换成管线连接或者by-pass的方式观察层析系统的基础压力是否超过正常，或者可以更换同类型的层析柱来观察检测到的压力变化是否较大。
（2）如果是层析柱超压，则按照清洗流程清洗层析柱。
（3）查看滤膜是否需要更换，如果滤膜堵塞或者变色，则更换滤膜。
11、蛋白和杂质分离不开？
（1）首先考虑分子筛需要蛋白和杂质的分子量大小相差2倍；
（2）上样量推荐为柱体积的2%-5%；适当降低上样量有利于提高纯度；
（3）适量添加去垢剂去减少聚集；
（4）适当降低流速；
（5）使用粒径更小，分辨率更高的分子筛；
（6）增加其他的纯化方法，例如离子交换、疏水、亲和层析等。
12、层析柱变色或者有色素如何去除？
色素性质很复杂，可以根据填料的耐受情况，优先尝试NaOH 清洗，另外，也可以使用有机溶剂（如 30% 异丙醇或乙醇），最后再尝试酸，如 0.01 M HCl。 如果去除不掉，可以定期把色素污染部分的填料去除。
13、分子筛是否可以连接蠕动泵操作？
不建议。蠕动泵流速控制不准确，会显著影响分离效果；蠕动泵无法检测运行时压力，可能出现超压运行的问题。
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