摘要
体外转录（In Vitro Transcription, IVT）技术是合成高质量信使 RNA（mRNA）的关键方法，在基因表达研究、疫苗开发和基因治疗等诸多领域展现出巨大的应用潜力。本文深入剖析了 IVT 反应的原理、优化策略以及 mRNA 质量分析的关键环节，详细阐述了各步骤的具体操作和注意事项，旨在为生命科学研究人员提供一份全面且系统的 IVT 技术指南，助力 mRNA 相关研究的高效开展。
前言
mRNA 作为一种关键的遗传信息载体，在细胞内负责将 DNA 的遗传信息传递给蛋白质合成 machinery，指导蛋白质的合成。随着生命科学的不断发展，对 mRNA 的体外合成需求日益增加。IVT 技术以其高效性、可控性和灵活性成为合成 mRNA 的核心手段。从基因克隆到个性化医疗，IVT 合成的 mRNA 在众多领域发挥着不可替代的作用，推动着科学研究和临床应用的不断进步。
一、IVT 反应的基本原理
IVT 过程的核心在于模拟细胞内转录过程。首先，RNA 聚合酶（如 T7、T3 或 SP6 RNA 聚合酶）识别并结合到启动子序列上。启动子序列位于 DNA 模板的特定区域，引导 RNA 聚合酶的结合与转录起始。一旦结合，RNA 聚合酶便沿着 DNA 模板链移动，以碱基配对原则逐个将核糖核苷酸（rNTP）添加到正在生长的 RNA 链上，从而合成 mRNA 序列。转录过程持续进行，直至 RNA 聚合酶遇到终止信号，如 poly(A) 尾的末端，此时转录反应停止，mRNA 合成结束。
在 IVT 过程中，5‘帽类似物的添加是 mRNA 合成的关键步骤之一。5‘帽结构对于 mRNA 的稳定性和翻译效率至关重要。共转录加帽技术能够在 mRNA 合成的同时添加 5‘帽结构，有效提高 mRNA 的质量。此外，修饰的尿苷核糖核苷酸（如 N1-甲基甲尿苷，N1-Methylpseudouridine）的使用是 IVT 反应的另一重要特点。这些修饰核苷酸能够显著增强 mRNA 的稳定性，降低其免疫原性，从而提高 mRNA 在体内的表达效率和使用寿命。
二、IVT 反应的优化策略
（一）IVT 缓冲液的优化
IVT 缓冲液的组成对转录效率和 mRNA 产量有着深远影响。针对共转录加帽效率进行优化的 IVT 缓冲液是提高 mRNA 产量的关键因素之一。例如，亚精胺的添加能够通过稳定 DNA 和 mRNA 结构，增强转录过程中的模板 - 聚合酶相互作用，从而提高转录效率。同时，镁离子作为 T7 RNA 聚合酶的辅助因子，其浓度对聚合酶活性至关重要。在 IVT 反应中，镁通常以乙酸镁的形式提供，合适的镁离子浓度能够维持聚合酶的活性并促进转录反应的顺利进行。
（二）rNTP 浓度的调控
rNTP 浓度是决定 mRNA 产量的另一个关键因素。高浓度的 rNTP 能够保证转录反应有足够的核苷酸原料，从而提高 mRNA 的合成速率和产量。此外，额外添加的 rA 对支持 poly(A) 尾的转录具有重要意义。poly(A) 尾是 mRNA 的重要组成部分，它能够增强 mRNA 的稳定性和翻译效率。因此，在 IVT 反应中，优化 rNTP 浓度和比例，特别是确保充足的 rA 供应，对于合成高质量的 mRNA 至关重要。
（三）修饰核苷酸的选择与应用
修饰的尿苷核糖核苷酸在 IVT 反应中发挥着多重作用。N1-Methylpseudouridine 能够有效增强 mRNA 的稳定性，降低其在体内和体外的免疫原性，同时提高 mRNA 的翻译效率。然而，根据实际应用需求，未修饰的尿苷和 5-Methoxyuridine 等其他修饰核苷酸也可以用于 IVT 反应。这些修饰核苷酸的选择需要综合考虑目标 mRNA 的用途、表达系统以及所需的稳定性和翻译效率等因素。
（四）焦磷酸盐的处理
在 IVT 反应过程中，会产生焦磷酸盐，焦磷酸盐会抑制 RNA 聚合酶的活性，从而影响转录反应的效率。为了解决这一问题，可以在反应体系中添加酵母无机焦磷酸酶（Yeast Inorganic Pyrophosphatase, YIPP）。YIPP 能够将焦磷酸盐分解为无机磷酸盐，从而消除其对转录反应的抑制作用，确保 IVT 反应的高效进行。
三、IVT 反应的时间控制
IVT 反应的速度相对较快，通常在 2 - 3 小时内即可完成。然而，转录过程的不同阶段对反应时间有着不同的要求。聚合酶的结合和转录起始是 IVT 的限速步骤，需要足够的时间以确保聚合酶的正确结合和转录的顺利启动。对于短模板而言，由于其转录过程相对较快，可能会导致 mRNA 产量较低。在这种情况下，适当延长孵育时间有助于提高 mRNA 的产量。而对于长模板，转录过程会更快地消耗 rNTP，因此需要密切监测反应进程，确保在 rNTP 耗尽之前停止反应，以避免产生大量废弃的和截短的 mRNA 分子。
四、mRNA 质量分析的关键环节
（一）毛细管凝胶电泳
毛细管凝胶电泳是验证 mRNA 产品质量和完整性的重要方法。完整的 mRNA 应呈现为单个、清晰的条带，其大小与预期相符。若电泳图中出现模糊的或拖尾的条带，则表明 mRNA 可能发生了降解或存在碎片。这些现象可能是由于 mRNA 的不稳定、反应体系中的污染或 IVT 性能不佳所导致的。Tapestation 系统是常用的检测设备之一，若实验室不具备自动凝胶电泳条件，也可以采用非变性琼脂糖凝胶进行检测。需要注意的是，由于 mRNA 的二级结构差异，某些 mRNA 可能会呈现多个条带。在这种情况下，使用变性凝胶能够帮助确认是否存在正确大小的 mRNA 分子。
（二）下一代测序（NGS）分析
下一代测序技术为 mRNA 的分析提供了更为深入和全面的视角。NGS 能够验证 mRNA 的序列准确性，提供 mRNA 的完整性信息以及 poly(A) 尾的详细特征。通过对 mRNA 进行深度测序，可以检测 mRNA 序列中的突变、剪接位点以及转录后的修饰情况，从而确保 mRNA 的质量和功能。此外，NGS 还能够分析 poly(A) 尾的长度和均一性，这对于评估 mRNA 的稳定性和翻译效率具有重要意义。
（三）5‘加帽效率的检测
5‘加帽效率是衡量 IVT 合成 mRNA 质量的另一个关键指标。高效的共转录加帽能够确保 mRNA 具备良好的稳定性和翻译能力。目前，已有多种方法可用于检测 5‘加帽效率。然而，在实际应用中，对于小批量的 mRNA 生产，由于共转录加帽的效率通常非常高（>99%），因此可能不需要进行常规的加帽检测。但在大规模生产和对 mRNA 质量要求极高的应用中，如 mRNA 疫苗和基因治疗，对 5‘加帽效率的准确检测仍然是必不可少的。
五、mRNA 质量控制的标准与指南
美国药典（U.S. Pharmacopeia，USP）为用于临床试验的 mRNA 分析提供了一系列关键质量属性和方法的指南。这些指南涵盖了 mRNA 的纯度、完整性、序列准确性、5‘加帽效率、poly(A) 尾长度以及免疫原性等多个方面，为确保 mRNA 产品的安全性和有效性提供了重要的参考依据。对于非临床试验，尤其是体内研究，建议在遵循 USP 指南的基础上，进一步开展额外的纯度测试和功能验证。这有助于全面评估 mRNA 的质量，确保其在实验研究中的可靠性和有效性。
六、IVT 技术的应用与展望
IVT 技术在生命科学研究和生物技术应用中展现出广阔的应用前景。从基因表达研究到蛋白质生产，从疫苗开发到基因治疗，IVT 合成的 mRNA 正逐渐成为这些领域的关键工具。例如，在 mRNA 疫苗的研发中，IVT 技术使得快速合成和优化编码抗原蛋白的 mRNA 成为可能，为应对传染病和癌症等疾病提供了新的策略。此外，随着基因编辑技术的不断发展，IVT 合成的 mRNA 也可用于递送基因编辑工具，实现对细胞内基因的精准编辑和调控。
然而，尽管 IVT 技术取得了显著的进展，但仍面临着一些挑战。进一步提高 mRNA 的产量和质量、降低生产成本以及优化 mRNA 的递送系统是当前研究的重点方向。未来，随着技术的不断创新和优化，IVT 技术有望在个性化医疗、再生医学和合成生物学等领域取得更大的突破，为人类健康事业做出更大的贡献。
结论
体外转录技术作为合成 mRNA 的核心方法，在基因表达调控、疾病治疗和预防等多个领域发挥着日益重要的作用。通过对 IVT 反应原理的深入理解、优化策略的合理应用以及 mRNA 质量分析的严格把控，我们能够合成出高质量的 mRNA 产品，为生命科学研究和临床应用提供有力支持。在未来的科研和应用实践中，持续探索和创新 IVT 技术，将有助于进一步拓展其应用范围，提升其在生物医学领域的影响力，为解决复杂的生物学问题和改善人类健康状况开辟新的途径。
| 名称 | 货号 | 规格 |
| T7 High Yield RNA Synthesis Kit | UA070079-50Rxns | 50Rxns |
| EGFP mRNA(N1-Methylpseudo-UTP) | abs60176-A-100ug | 100ug |
| mRNA转染试剂 | abs60339-1mL | 1mL |
| easyLNP™ mRNA体内转染试剂盒（全身作用） | abs60622-0.3mL | 0.3mL |
