Progenitor Cells Play a Role in Reinstatement of Ethanol Seeking in Adult Male and Female Ethanol Dependent Rats

一、研究背景

二、研究目的

三、研究方法

（一）动物模型

（二）实验流程

1. 乙醇自我给药训练 ：实验初始阶段，大鼠被训练在操作性条件反射箱中进行杠杆按压以获取乙醇奖励。通过固定比例 1（FR1）的强化方案，使大鼠学会将按压特定杠杆与获得乙醇奖励联系起来。训练过程持续进行，直至大鼠的行为稳定，即主动杠杆按压次数的变异系数小于 10%，连续 3 个 30 分钟 FR1 会话期间。
2. 慢性间歇性乙醇蒸汽暴露（CIE） ：完成乙醇自我给药训练后，大鼠进入为期 6 周的 CIE 阶段。大鼠被安置于特殊实验舱内，接受 14 小时开启、10 小时关闭的乙醇蒸汽循环暴露。通过精确控制乙醇流量和空气压力，使大鼠体内血液乙醇浓度（Blood Alcohol Levels, BALs）维持在 125 至 250 mg% 范围内，该浓度为模拟人类酗酒后乙醇水平的 2 至 3 倍，但不足以导致大鼠丧失右侧反射。
3. 抑制细胞增殖处理 ：在 CIE 的最后一个月，给予大鼠 Valcyte（缬更昔洛韦）或安慰剂处理。Valcyte 是一种口服前药，经体内代谢后转化为更昔洛韦，能够选择性地杀死表达 HSV-TK 的增殖细胞，从而抑制祖细胞的增殖。
4. 复发饮酒测试 ：经过两周的强制戒酒后，大鼠接受复发饮酒测试，以评估其对乙醇的渴望和消费行为。测试过程与训练阶段的条件相同，记录大鼠在两个 30 分钟 FR1 会话期间的乙醇消费量以及主动和非主动杠杆按压次数。
5. 消退训练 ：复发测试结束后，大鼠进入消退训练阶段，共持续 6 天。在消退训练期间，大鼠被置于与训练和维持阶段不同的操作箱内，开启背景灯光和白噪音，且杠杆按压不再与乙醇奖励相关联，同时去除线索灯光。记录大鼠在消退过程中的主动和非主动杠杆按压次数。
6. 再燃测试 ：在第六天消退训练结束后，大鼠接受一次 30 分钟的线索 - 情境诱发乙醇寻求再燃测试。将大鼠重新置于与训练和维持阶段相同的操作箱内，关闭背景灯光和白噪音，当大鼠按压主动杠杆时，会触发 4 秒的线索灯光显示，但不会获得乙醇奖励。记录大鼠的主动和非主动杠杆按压次数。

（三）数据采集与分析

1. 行为测试 ：精确记录大鼠在各个阶段的乙醇消费量、主动杠杆按压次数以及消退行为的潜伏期等行为学指标。
2. 组织学分析 ：对大鼠大脑进行组织学处理，采用免疫组织化学方法检测 Ki-67 标记的增殖细胞以及 Olig2 标记的少突胶质细胞，通过光镜观察和图像分析软件对细胞数量、分布及形态进行定量分析。
3. Western blot 分析 ：提取大鼠大脑组织中的蛋白质，通过 Western blot 技术检测与神经免疫反应和 BBB 完整性相关的蛋白表达水平，包括环氧化酶 - 2（Cox-2）、核因子 - κB（NF-κB）、血管内皮钙黏蛋白（Cdh5）和闭合蛋白 - 5（Cld5）等。
4. 血浆细胞因子检测 ：采集大鼠血浆样本，利用多重细胞因子免疫分析方法，测定其中促炎和抗炎细胞因子以及趋化因子的水平，包括干扰素 - γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子 - α（TNF-α）、白细胞介素 - 6（IL-6）、白细胞介素 - 4（IL-4）、白细胞介素 - 13（IL-13）和趋化因子 CxCL-1 等。

四、研究结果

（一）性行为差异

（二）Valcyte 对复发的影响

1. 乙醇消费量 ：对复发期间乙醇消费量的分析显示，性别 × Valcyte 交互作用显著（F (1, 50)=4.0; p=0.05），性别主效应显著（F (1, 50)=12.7;p<0.001），而 Valcyte 主效应不显著（F (1, 50)=2.9; p=0.09）。进一步的事后分析发现，与接受安慰剂的雄性大鼠相比，接受 Valcyte 处理的雄性大鼠在复发期间的乙醇消费量更高（p<0.05），而雌性大鼠则未出现这种变化。这表明 Valcyte 对雄性大鼠的复发行为产生了特定影响，可能暗示着祖细胞在雄性大鼠的复发机制中具有更为关键的作用。
2. 消退行为潜伏期 ：在消退过程中，对于雌性大鼠，两因素方差分析结果显示，消退天数对主动杠杆按压次数有主效应（F (5, 115)=25.9;p<0.001），但未发现消退天数 × Valcyte 交互作用或 Valcyte 主效应。进一步分析表明，雌性大鼠在安慰剂和 Valcyte 组之间消退乙醇线索反应的潜伏期无差异（Kolmogorov–Smirnov D=0.33, p=0.9）。而对于雄性大鼠，两因素方差分析结果显示，消退天数 × Valcyte 交互作用显著（F (5, 130)=2.5; p=0.03），Valcyte 主效应显著（F (1, 26)=9.2; p=0.005），消退天数主效应也显著（F (5, 130)=24.8; p<0.001）。事后分析显示，与安慰剂组相比，Valcyte 组雄性大鼠在消退第一天的主动杠杆按压次数更高。此外，Kolmogorov–Smirnov 检验进一步揭示了 Valcyte 组雄性大鼠与安慰剂组相比，消退乙醇线索反应的潜伏期延长（D=0.83, p=0.02）。这表明 Valcyte 处理可能影响了雄性大鼠在消退过程中的学习和记忆过程，使得雄性大鼠在 Valcyte 处理后更难完成消退任务。

（三）Valcyte 对祖细胞增殖的影响

（四）免疫反应和 BBB 完整性

1. 血浆细胞因子水平变化 ：研究发现，在雌性大鼠中，与初体验大鼠和 Valcyte 处理大鼠相比，接受安慰剂的 CIE 大鼠血浆中 TNF-α 水平升高（F (2, 19)=7.8; p=0.003），而 IL-6 水平降低（F (2, 19)=9.1; p=0.001）。在雄性大鼠中，安慰剂处理的 CIE 大鼠血浆中 IFN-γ（F (2, 24)=9.4; p<0.001）、IL-6（F (2, 24)=3.6; p=0.03）和 CxCL-1（F (2, 24)=10.6; p<0.001）水平升高，同时 IL-4（F (2, 24)=3.3; p=0.05）和 IL-13（F (2, 24)=5.3; p=0.01）水平也升高。而 Valcyte 处理逆转了这些细胞因子水平的变化，具体表现为在雌性大鼠中 TNF-α 水平降低、IL-6 水平升高，在雄性大鼠中 IFN-γ、IL-6、CxCL-1、IL-4 和 IL-13 水平均降低。这些结果表明，祖细胞可能参与调节机体的免疫反应，进而影响乙醇寻求行为。
2. BBB 完整性相关蛋白表达 ：在 mPFC 中，Valcyte 或安慰剂处理均未改变 Cox-2 的表达水平。对于 NF-κB 的活性状态（通过磷酸化与总蛋白比值评估），Valcyte 处理显著提高了雌性大鼠的 p/t NF-κB 表达（F (2, 19)=4.2; p<0.05），雄性大鼠未见此效应。在 DG 中，Valcyte 或安慰剂处理对 Cox-2 和 p/t NF-κB 的表达均无影响。然而，Valcyte 处理显著逆转了安慰剂处理引起的 Cld5（一种紧密连接蛋白）表达降低的现象，在雌性大鼠的 DG 中，安慰剂处理降低了 Cld5 表达（F (2, 19)=5.9; p<0.05），而 Valcyte 处理防止了这一变化；在雄性大鼠的 DG 中，安慰剂处理同样降低了 Cld5 表达（F (2, 26)=8.0; p<0.05），Valcyte 处理则有效防止了 Cld5 的降低。这表明祖细胞可能通过调节 BBB 完整性相关蛋白的表达，影响 BBB 的功能，进而参与乙醇寻求行为的调控。

（五）小胶质细胞活性

（六）少突胶质细胞数量

五、研究意义

六、未来研究方向

1. 探讨祖细胞在不同大脑区域中的具体作用机制，尤其是其在神经可塑性、突触功能和神经递质释放等方面的作用。
2. 进一步研究祖细胞与神经免疫系统之间的相互作用机制，包括祖细胞如何感知和响应免疫信号，以及免疫细胞如何反过来影响祖细胞的行为。
3. 开发和优化针对祖细胞的药物或非药物干预策略，评估其在预防和治疗 AUD 中的安全性和有效性。
4. 探索祖细胞在其他精神疾病和神经系统疾病中的作用，比较不同疾病状态下祖细胞的异同，为跨疾病治疗提供理论依据。

 

名称	货号	规格
V-PLEX Proinflammatory Panel1 (human) Kit (1 Plate)	K15049D-1	1Plate
V-PLEX Proinflammatory Panel1 (human) Kit (5 Plate)	K15049D-2	5Plate
V-PLEX Proinflammatory Panel1 (human) Kit (25 Plate)	K15049D-4	25Plate
Cox2 (D5H5) XP® Rabbit mAb	12282S	100ul