B细胞作为体液免疫的主力军，与负责细胞免疫的T细胞相辅相成，共同构成适应性免疫。抗原进入机体后诱导相应的抗原特异性B细胞活化、增殖并最终分化为浆细胞，产生特异性抗体进入体液，发挥免疫效应。除此之外，B细胞形态功能的异常也与B细胞肿瘤、自身免疫疾病、神经免疫性疾病等多种疾病相关。
接下来小优会从B细胞来源-激活扩增-诱导分化与培养-鉴定-热门研究四个方面带大家通关B细胞的培养！之前小优也给大家介绍了《免疫卫士-T细胞培养攻略》，《DC细胞培养攻略》，小伙伴们按需查看呦~
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B细胞来源
B细胞由哺乳动物骨髓中的淋巴样干细胞分化发育而来，经历祖B细胞（pro-B-cell）、前B细胞（pre-B-cell）、未成熟B细胞（immature B cell）、成熟B细胞（mature B cell）等几个阶段。早期pro-B开始进行免疫球蛋白基因重排，但是此时没有mIgM的表达。前B细胞表面表达前B细胞受体（pre-BCR），而后发育成未成熟B细胞。未成熟B细胞表达完整BCR，接受抗原刺激后，有一部分会在阴性选择中死亡或者失活，对自身有反应性的B细胞则被去除，存活的部分就进入外周淋巴器官，不成熟B细胞作为过渡型B细胞进入脾脏，并通过BAFF受体接收生存信号，然后根据BCR特异性完成发育的第一阶段，成为边缘区（MZ）B细胞或是滤泡（FO）B细胞。当边缘区B细胞接触到抗原，并得到新生辅助细胞的支持时，就会发展成为短寿命的浆细胞。滤泡B细胞则通过抗原结合被激活，并在辅助T细胞的支持下，在生发中心（GCs）中发育成为记忆B细胞（memory B cells）或是浆细胞（plasma cell）[1]。
所以体外培养的B细胞来源可以是实体组织（脾脏、扁桃体、淋巴结等）、血液组织或者直接购买商品化的原代B细胞（4W-601），方便快捷，品质有保障。具体样本制备和细胞分选的内容，小伙伴们可以参考之前的文章：《免疫细胞培养通关技巧之样本制备》和《免疫细胞培养通关技巧之细胞分选》。
图1 B细胞的发育[1]
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B细胞激活
与T细胞相似，B细胞活化也需要双信号：BCR在与抗原（T细胞依赖抗原，TD-Ag）特异性结合后即启动B细胞活化的第一信号，由BCR-CD79a/b（BCR-Igα/β）和CD19/CD21/CD81共同传递；B细胞活化的第二信号又称为共刺激信号，由Th细胞与B细胞表面多对共刺激分子相互作用产生，其中最重要的是CD40/CD40L。另外，Th细胞分泌的细胞因子也能够促进B细胞的活化、增殖和分化。需要注意的是，如果只有第一信号没有第二信号，B细胞不仅不能活化，反而会进入失能的耐受状态。
图2 B细胞的激活
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还有另一种不依赖T细胞的B细胞激活方式，一般会使用T细胞非依赖抗原（TI-Ag），如细菌多糖、多聚蛋白质及脂多糖等，与B细胞表面的分子而不是细胞受体结合，并聚集这些分子，这样一来与这些分子相关的BCR也会聚集在一起，这种“多克隆”B细胞的激活是不依赖于被BCR识别的同源抗原的，BCR仅仅是受骗才赶过来的。根据激活B细胞方式的不同，TI抗原又可分为TI-1抗原（LPS）和TI-2抗原（细菌胞壁与荚膜多糖）。成熟和不成熟的B细胞均可被TI-1抗原激活，诱导产生低亲和力的IgM；TI-2抗原仅能激活成熟B细胞，通过其高度重复的抗原表位引起B1细胞的mIg广泛交联，进而激活B1细胞。
图3 TI-1和TI-2抗原[2]：TI-1抗原能够与BCR及丝裂原受体结合，在没有T 细胞辅助的情况下激活B 细胞；TI-2 抗原则通过交联多个BCR激活B细胞。
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举例：B细胞体外激活扩增实验步骤
（1）基质细胞的准备
10 cm细胞培养皿预先接种表达CD40L的基质细胞，作为B细胞培养的滋养层细胞。
（2）B细胞接种
将B细胞接种至10 cm培养皿（6 mL/皿）的饲养层细胞上，调整B细胞密度为100/cm2。
（3）培养条件设置
R5培养基（含有5%人血清、55 µM 2-巯基乙醇（abs9592-100mL）、2 mM L-谷氨酰胺（abs9354-100mL）、100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素（abs9244-100mL）、10 mM HEPES（abs42150994-100mL）、1 mM丙酮酸钠（abs9296-100mL）和1%MEM非必需氨基酸（abs9298-100mL），并补充重组人IL-2（50 ng/mL）（abs06485-25ug）、IL-4（10 ng/mL）（UA040026 -50μg）、IL-21（10 ng/mL）（8879-IL-010/CF），和BAFF（10 ng/mL）（2149-BF-01M/CF）），连续培养B细胞8天，培养时间根据实验目的可进行改变。培养期间可观察到B细胞克隆团的形成（图）。
图4 人naïve B细胞体外激活扩增形成的克隆团[3]
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（4）培养基更换
在第4天和第6天，弃去一半旧培养基（避免触碰底部细胞），并用预热的、含细胞因子的新鲜R5培养基等量替换。当培养时间超过8天时，须在第8天将B细胞转移至新的饲养层细胞上，同样在转移后的第4、6天等量替换培养基。细胞培养结束后，收集B细胞进行计数，进行后续的实验或在液氮中冷冻保存待用。
B细胞诱导分化与培养
经过双信号刺激而完全活化的B细胞具备了增殖和继续分化的能力。在Th细胞产生的细胞因子的辅助下，活化B细胞增殖形成生发中心，并经历T细胞高频突变、Ig亲和力成熟和类别转换，分化为浆细胞或记忆B细胞，发挥体液免疫功能。接下来，就以记忆B细胞和浆细胞的体外分化举例吧。
01记忆B细胞体外分化与增殖[4]
a) 准备3T3-msCD40L细胞：
将3T3-msCD40L细胞种植在细胞培养瓶中，并在细胞达到80-90%融合度时收集。
b) 细胞分选：
使用流式细胞分选技术，分离出CD19+IgM–IgA–IgD–B细胞。
c) 细胞培养：
将分选的B细胞以1.3-4个细胞每孔的密度接种到384孔板中，每个孔含有50 μL的完全培养基。384孔板最外围一圈加入100 μL无菌水以防止液体蒸发。
完全培养基配方：3.5 mL IL-2（10000U/ml）（UA040057-50μg）+175 μL IL-21（100μg/ml）（abs05146-50ug）+10 ml辐射处理过的3T3-msCD40L细胞（共3.5x107cells）+336 mL Complete IMDM培养基（abs9441-500mL）。
d) 培养条件：
细胞在5% CO2和37°C的条件下培养13-14天。
e) 监测和收集上清液：
在培养过程中，需不时在显微镜下观察，大概第10天左右，可观察到B细胞扩增克隆团，可在第12天测量上清液中的IgG浓度（abs551021-96T，Human IgG ELISA Kit）以分析记忆B细胞的分化效果。
02浆细胞体外分化与增殖[5]
a) 细胞准备：
从健康供体的血液中使用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMCs）（17144003-1，或abs930-200mL）。
b) B细胞分选：
使用磁珠分选方法从PBMCs中分选总B细胞（130-101-638）。
c) 体外B细胞培养：
将B细胞以2.5×105cells/mL的密度接种到48孔板中培养，可使用CellTrace Violet（CTV）（48444）标记B细胞，以追踪细胞分裂。
d) 刺激条件：
使用4组不同的刺激条件，包括CpG ODN 2395（abs9983-5mg）、可溶性CD40配体（sCD40L）、重组人IL-2和IL-10（abs06283-50ug）等，以诱导B细胞分化为浆细胞。
| 方案 | 组分 |
| I | 5 μg/mL CpG ODN 2395, 1 μg/mL sCD40L, 100 ng/mL IL-2, 100 ng/mL IL-10 |
| II | 5 μg/mL CpG, 5 μg/mL PWM, 1:10.000 SAC |
| III | 5 μg/mL anti-human IgM F(ab')2, 2,5 μg/mL CpG, 1 μg/mL sCD40L, 50 ng/mL IL-21 |
| IV | 5 μg/mL anti-human IgM F(ab')2, 2.5 μg/mL CpG, 50 ng/mL sCD40L, 5 ng/mL IL-2；第4天更换为：5 ng/mL IL-2，10 ng/mL IL-4, 10 ng/mL IL-10 |
e) 流式细胞术检测：
第3.5天和第6天可通过流式细胞术分析B细胞表面标志物，如CD38（130-113-431）、CD20（556633）和转录因子的表达。
f) ELISA检测：
在培养第6天收集培养上清液，用于ELISA检测IgG的产生。
g) 最佳浆细胞分化方案：
通过流式细胞术和ELISA确定方案IV为四种方案中最佳的。
图5 浆细胞的体外分化实验方案及检测
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03记忆B细胞分化为浆细胞[6]
a) B细胞分选：
使用磁珠分选方法，从健康供体的外周血单个核细胞（PBMCs）中分选出CD27+记忆B细胞（130-051-601）。
b) 培养基准备：
使用RPMI-1640培养基（abs9484-500mL），补充L-谷氨酰胺、1%青霉素/链霉素和10%胎牛血清（abs972-500mL或SV30208.02）。
c) 细胞培养和刺激：
按照1:1-1:50的比例加入饲养层细胞（辐射过的CD154+HEK-293T），然后将分选得到的记忆B细胞以8×103cells/mL的密度接种到96孔板中培养或1×106cells/mL的密度接种到24孔板中培养（96孔板用于上清液中Ig定量，24孔板用于流式细胞术表型分析）。
接着使用不同的刺激剂组合用于记忆B细胞分化为浆细胞，包括IL-2（100–1000 U/ml）、IL-6 (10–100 ng/ml)（UA040052-50μg）、IL-15 (10–100 ng/ml)（abs05147-10ug）、IL-21(10–100 ng/ml)、APRIL(10–100 ng/ml)、BAFF（10–100 ng/ml）、CpG ODN2006（0.25–10 μg/ml）（130-100-105）、R848（0.25–5 μg/ml）和商陆丝裂原5–100 ng/ml（abs810694-50mg）等。细胞在5% CO2和37°C的条件下培养5-10天。
d) 最佳扩增条件：
IL-21浓度：100 ng/mL。R848浓度：0.5 μg/mL。CD40刺激：使用CD154+ HEK293T细胞作为饲养层细胞，与记忆B细胞的比例为1:1。
小优也汇总了一些常见的B细胞分化方案，可供参考~
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IL-2 Protein, Human UA040057
促进B细胞的存活和增殖
IL-4 Protein, Human UA040026
促进B细胞向IgE和IgG1类别转换
IL-10 Protein, Human UA040176
与IL-4协同作用，促进类别转换
IL-21 Protein, Human UA040009
促进B细胞的存活和分化
BAFF Protein, Mouse UA040278
促进B细胞存活、成熟和类别转换
R848 abs810694
一种TLR7/8激动剂，可促进B细胞的激活、增殖和分化
CD40L Protein，Human abs00854
与CD40结合，模拟T细胞与B细胞的相互作用
B细胞鉴定
B细胞鉴定通常是通过流式细胞术实现的，B细胞不同亚型、标记物可以参考图7[7]。关于流式鉴定的基本内容大家可以参考《免疫细胞培养通关技巧之分型鉴定》。
图7 human-B细胞表面标记物[7]
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文中部分相关产品
CD19-FITC, human, REA675, 100 tests 130-113-645
应用于FC, MICS, IF, IHC
PE Mouse Anti-Human CD22(HIB22) 562859
应用于FC
B细胞热门研究
关于B细胞的热门研究也有很多，诸如BCR功能、Breg、B细胞与三级淋巴结等。以B细胞与三级淋巴结构 （TLS, Tertiary lymphoid structures）相关研究为例：TLS是一种异位淋巴器官，在慢性抗原刺激的条件下在炎症组织中形成。成熟的TLS包含T细胞区和B细胞区，T细胞区位于周边，B细胞区位于TLS中心。在TLS中的B细胞可以从滤泡树突细胞（FDCs）获得递呈抗原，产生针对相应抗原的抗体。因此TLS可以在肿瘤部分发生特异性的免疫反应。我们可以研究TLS中的B细胞类型、B细胞分泌的趋化因子（LXLBH10-1，人10因子检测panel）、抗体类型等，比如通过转录组+mIHC（abs50013-20T，五色多重荧光免疫组化染色试剂盒）的方法揭示三级淋巴结中B细胞IgG类别转换为例：IgG同种型（IGHG1-4）在TLS+肿瘤中富集；IgA同种型（IGHA1-2）在TLS-肿瘤中富集[8]。
图8 B细胞热门研究思路汇总
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关于B细胞的内容就到这里啦，更多细胞培养攻略敬请期待~
1. Pieper, K., B. Grimbacher, and H. Eibel, B-cell biology and development. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2013. 131(4): p. 959-971.
2. 医学免疫学_第9版
3. Su, K.-Y., et al., Efficient Culture of Human Naive and Memory B Cells for Use as APCs. The Journal of Immunology, 2016. 197(10): p. 4163-4176.
4. Huang, J., et al., Isolation of human monoclonal antibodies from peripheral blood B cells. Nature Protocols, 2013. 8(10): p. 1907-1915.
5. Khoenkhoen, S., et al., Flow Cytometry-Based Protocols for the Analysis of Human Plasma Cell Differentiation. Frontiers in Immunology, 2020. 11.
6. Muir, L., et al., Optimisation of ex vivo memory B cell expansion/differentiation for interrogation of rare peripheral memory B cell subset responses. Wellcome Open Research, 2017. 2.
7. Levesque, M.C. and E.W. St. Clair, B cell–directed therapies for autoimmune disease and correlates of disease response and relapse. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2008. 121(1): p. 13-21.
8. Zhang, Y., et al., CCL19-producing fibroblasts promote tertiary lymphoid structure formation enhancing anti-tumor IgG response in colorectal cancer liver metastasis. Cancer Cell, 2024. 42(8): p. 1370-1385.e9.
