巨噬细胞培养攻略

巨噬细胞（Macrophages，mø）作为先天免疫的核心成员，可以通过吞噬作用清除病原体、死亡细胞和异物；同时具备抗原呈递功能，将处理后的病原体片段呈递给T细胞，启动适应性免疫应答。不仅如此，巨噬细胞还能够在特定组织中分化成功能不一的组织驻留巨噬细胞：如库普弗细胞（肝脏）、小胶质细胞（脑部）等。
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接下来小优会从巨噬细胞来源-诱导分化与培养-鉴定-热门研究四个方面带大家通关不同来源的NK细胞培养！之前小优也给大家介绍了《免疫卫士-T细胞培养攻略》，《B细胞培养攻略》，《NK细胞培养攻略》小伙伴们按需查看呦~
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巨噬细胞来源
在骨髓中，造血干细胞分化为单核细胞前体细胞（MDCP），再进一步分化为两种单核细胞亚群，即Ly6C+CX3CR1loCCR2+CD62L+和Ly6CloCX3CR1hiCCR2−CD62L−。这两种单核细胞均可以通过CCR2和MCP-3信号传导被动员至血液，一旦进入血管，单核细胞就可以通过血管外渗离开血管，并通过CCR2和CX3CR1信号传导到达组织成为各具特点的组织驻留巨噬细胞[1]。所以体外培养的巨噬细胞来源可以是实体组织（骨髓、脾脏、肝脏、淋巴结等）、血液、直接购买商品化的原代单核/巨噬细胞（4W-400）或单核/巨噬细胞系（THP1、Raw264.7等）。

巨噬细胞发育[1]

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巨噬细胞诱导分化与培养
巨噬细胞分化是科学研究中很重要的一部分，由于巨噬细胞的可塑性，未分化的巨噬细胞（M0）分化为两种类型：经典活化巨噬细胞（M1）和交替活化巨噬细胞（M2）。M1应对LPS、IFN-γ等刺激，分泌大量的促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β等），发挥促炎、抗菌功能；而M2应对 IL-4、IL-13等刺激，分泌大量的抗炎细胞因子（IL-10、IL-1RA等），发挥抗炎、促进伤口愈合的作用[2]。

巨噬细胞分化[2]

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体外实验中也可以通过添加上述刺激物诱导单核/巨噬细胞的分化，接下来，小优会从原代单核/巨噬细胞（单核来源的巨噬细胞、骨髓来源的巨噬细胞）、单核/巨噬细胞系（THP-1、U-937、Raw264.7、J774a.1）诱导分化与培养两个方面为大家详细介绍：
一、原代单核/巨噬细胞诱导分化
1.单核来源的巨噬细胞（Monocyte Derived Macrophage，MDM）分化成M1、M2[3]
单核来源的巨噬细胞由外周血单核细胞经GM-CSF或M-CSF诱导分化而来，具有较强异质性，可模拟炎症状态下单核细胞向组织迁移分化的过程，常用于研究感染、肿瘤等病理环境中的巨噬细胞功能。
①使用FICOLL PAQUE PLUS 1.077（17144003-1）从人的外周血中提取PBMC；
②使用CD14 MicroBeads, human（130-050-201）磁珠分选CD14+单核细胞；
③使用完全培养基（RPMI1640（SH30809.01）+10%FBS（SV30208.02）+1%PS（SV30010））重悬单核细胞，并以5*10^5/ml接种于12孔板，加入20 nM M-CSF（UA040128）; 
④培养7天，每3天更换一次培养基并添加M-CSF，即可获得MDM（M0）；
⑤M1分化：向上述M0细胞中加入1 μg/ml LPS（abs47014848-5mg）和10 ng/ml IFN-γ（UA040065）培养48h；
⑥M2分化：向上述M0细胞中加入20 ng/ml IL-4（UA040192）和5 ng/ml IL-13（UA040158）培养48h。

2.骨髓来源的巨噬细胞（Bone Marrow Derived Macrophage，BMDM）分化成M1、M2[4]
骨髓来源的巨噬细胞由骨髓前体细胞经M-CSF培养获得，分化均一性高，增殖能力强，适合体外大规模实验，广泛应用于基础免疫研究及药物筛选。
① 处死小鼠后分离股骨和股骨，使用含2%FBS（SV30208.02）的PBS（SH30256.01）冲洗小鼠骨髓腔，收集冲洗液后反复吹打骨髓悬液，70 μm筛网（abs7232）过滤去除碎骨和团块；
②使用完全培养基（IMDM（SH30228.01）+10%FBS（SV30208.02））重悬骨髓细胞，并以2*10^6/ml接种于12孔板，加入10 ng/ml M-CSF（216-MCC-025/CF）；
③培养7天，每3天更换一次培养基并添加M-CSF，即可获得BMDM（M0）；
注意：在第7天，可通过流式细胞术评估成熟BMDM（CD11b+F4/80+）的形成。
④M1分化：向上述M0细胞中加入100 ng/ml LPS（abs47014848-5mg）和50 ng/ml IFN-γ（285-IF-100/CF）培养48h；
⑤M2分化：向上述M0细胞中加入10 ng/ml IL-4（404-ML-010/CF）和10 ng/ml IL-13（285-IF-100/CF）培养48h。

小鼠BMDMs的分离、形成和刺激方案[4]

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二、单核/巨噬细胞系诱导分化
1.THP-1分化成M0、M1、M2[3, 5]
THP-1：人单核细胞白血病细胞系，可经PMA（佛波酯）诱导分化为巨噬细胞样细胞，常用于研究炎症、免疫调控及肿瘤相关巨噬细胞的功能，适合模拟人源单核/巨噬细胞响应。
①使用完全培养基（RPMI1640（SH30809.01）+10%FBS（SV30208.02）+1%PS（SV30010）+0.05mM β-巯基乙醇（abs9592-100mL））重悬THP-1细胞，并以5*10^5/ml接种于12孔板，加入100 ng/ml 佛波酯PMA（abs9107-5mg）,培养48h，即可获得M0细胞；
②M1分化：向上述M0细胞中加入100 ng/ml LPS（abs47014848-10mg）和20 ng/ml IFN-γ（abs04123-50ug）培养48h；
③M2分化：向上述M0细胞中加入20 ng/ml IL-4（abs04698-100ug）和20 ng/ml IL-13（abs00816-10ug）培养48h。

2.U-937分化成M1、M2[6]
U-937：人淋巴瘤来源的单核细胞系，也可通过PMA分化为巨噬细胞，但分化效率低于THP-1，多用于病毒侵染、免疫代谢及肿瘤微环境研究。
①使用完全培养基（RPMI1640（SH30809.01）+10%FBS（SV30208.02）+1%PS（SV30010））重悬U-937细胞，并以2*10^6/ml接种于12孔板，加入100 ng/ml 佛波酯PMA（abs9107-5mg）,培养48h，移除PMA后，可静置培养48–96小时，以形成稳定M0表型；
②M1分化：向上述M0细胞中加入10 ng/ml LPS（abs47014848-10mg）和10 ng/ml IFN-γ（UA040065）培养48h；
③M2分化：向上述M0细胞中加入25 ng/ml IL-4（UA040192）和25 ng/ml IL-13（UA040158）培养48h。

3.Raw264.7分化成M1、M2[7]
RAW 264.7（相当于M0）：Raw264.7：小鼠白血病来源的巨噬细胞系，无需诱导即可直接培养，增殖快且易转染，广泛用于炎症信号通路（如NF-κB）、吞噬功能及脂代谢研究。
①使用完全培养基（DMEM（SH30243.01）+10%FBS（SV30208.02）+1%双抗（SV30010））重悬RAW264.7细胞，并以2.5*10^5/ml接种于12孔板；
②M1分化：向上述RAW264.7细胞中加入100 ng/ml LPS（abs47014848-5mg）培养24h；
③M2分化：向上述RAW264.7细胞中加入20 ng/ml IL-4（404-ML-010/CF）培养24-48h。

4.J774A.1分化成M1、M2[8]
J774A.1（相当于M0）：小鼠巨噬细胞系，具有较强吞噬活性，常用于细菌感染、泡沫细胞形成及细胞因子分泌研究，但分化特性较原代巨噬细胞弱。
①使用完全培养基（RPMI1640（SH30809.01）+10%FBS（SV30208.02）+1%PS（SV30010））重悬J774A.1细胞，并以1*10^5/ml接种于12孔板； 
②M1分化：向上述J774A.1细胞中加入100 ng/ml LPS（abs47014848-10mg）培养24h；
③M2分化：向上述J774A.1细胞中加入5ng/ml IL-13（abs00816-10ug）培养24h；
温馨提示：关于单核巨噬细胞的培养要点，大家可以看《Raw264.7、THP1、MH-S、J774A.1，单核-巨噬细胞系培养合集来袭！》这篇文章。
小优也汇总了上述来源的巨噬细胞体外诱导分化方案，可供参考~
 

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巨噬细胞鉴定

巨噬细胞亚型（M1、M2）鉴定最常用的方法是流式。常用的巨噬细胞标记物包括CD11b、CD14、CD16、CD68、F4/80（小鼠）。CD80和CD86常用作M1型巨噬细胞标记物，而CD163和CD206则为M2型巨噬细胞的标志。
另外需要注意的是，巨噬细胞具有异质性，比如在小鼠的不同组织中，巨噬细胞对应检测指标不同，大家可以参考下表。

小鼠组织驻留巨噬细胞对应标记物及功能[9]

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除了流式细胞术，还可以使用qRT-PCR确定激活的M1和M2巨噬细胞特征基因的表达，包括IL-1β、TNF-α和IL-6（M1激活）或IL-10、IL-13、arginase1和PPARγ（M2激活）；或者通过Western blot分析确定参与M1或M2巨噬细胞激活的细胞信号通路的激活。

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巨噬细胞热门研究
巨噬细胞的热门研究也非常多，比如巨噬细胞的功能和调控机制、巨噬细胞与免疫逃逸、巨噬细胞与代谢（糖酵解、代谢重编程）等。例如《25-Hydroxycholesterol regulates lysosome AMP kinase activation and metabolic reprogramming to educate immunosuppressive macrophages》发现了一个新的巨噬细胞免疫代谢检查点：CH25H（胆固醇-25-羟化酶）。TAMs中CH25H的表达增加，导致25HC（CH25H）在溶酶体中积累。25HC通过与GPR155-mTORC1复合体相互作用，抑制mTORC1，激活AMPKa，进而磷酸化STAT6，增强其活性，促进ARG1产生，增强TAMs的免疫抑制功能。另外，CH25H缺失的巨噬细胞可将“冷肿瘤”转变为“热肿瘤”，提高抗PD-1疗法的抗肿瘤效果。研究还表明，25HC促进氧化磷酸化和线粒体功能，进而使巨噬细胞向免疫抑制亚群分化。因此：靶向CH25H可改善抗肿瘤免疫反应，为肿瘤治疗提供新策略。

文章图形摘要

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巨噬细胞与代谢研究思路图

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