Bleomycin induces fibrotic transformation of bone marrow stromal cells to treat height loss of intervertebral disc through the TGFβR1/Smad2/3 pathway
摘要
椎间盘退变（Intervertebral Disc Degeneration, IDD）是导致腰痛和脊柱功能障碍的主要原因，其特征是椎间盘高度丢失和髓核组织退化。目前的治疗方法包括保守治疗和手术治疗，但效果有限。本研究旨在探讨博莱霉素（Bleomycin）通过TGFβR1/Smad2/3通路诱导骨髓基质细胞（Bone Marrow Stromal Cells, BMSCs）纤维化转化，从而治疗椎间盘高度丢失的潜力。研究结果表明，博莱霉素能够显著促进BMSCs的纤维化转化，通过TGFβR1/Smad2/3信号通路上调纤维化相关基因的表达，从而有效治疗椎间盘高度丢失。这些发现为IDD的治疗提供了新的策略和理论依据。
一、引言
椎间盘退变（IDD）是导致腰痛和脊柱功能障碍的主要原因，其特征是椎间盘高度丢失和髓核组织退化。IDD的发病机制复杂，涉及遗传、环境和机械因素。目前的治疗方法包括保守治疗（如物理治疗、药物治疗）和手术治疗（如椎间盘置换、椎间融合术），但这些方法的效果有限，且存在一定的风险和并发症。因此，寻找新的治疗方法具有重要意义。
近年来，细胞治疗和基因治疗在IDD的治疗中显示出巨大的潜力。骨髓基质细胞（BMSCs）是一种多能干细胞，具有分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等的能力。BMSCs在组织修复和再生中具有重要作用，但其在IDD治疗中的应用尚不明确。博莱霉素（Bleomycin）是一种常用的化疗药物，具有诱导细胞凋亡和促进纤维化的作用。本研究旨在探讨博莱霉素通过TGFβR1/Smad2/3通路诱导BMSCs纤维化转化，从而治疗椎间盘高度丢失的潜力。
二、研究背景
椎间盘由髓核、纤维环和软骨终板组成，其中髓核主要由胶原蛋白和蛋白聚糖组成，维持椎间盘的弹性和高度。IDD过程中，髓核组织退化，胶原蛋白和蛋白聚糖减少，导致椎间盘高度丢失和功能障碍。BMSCs具有分化为髓核细胞和纤维环细胞的潜力，因此在IDD治疗中具有重要作用。博莱霉素通过诱导细胞凋亡和促进纤维化，可能在BMSCs的纤维化转化中发挥作用。TGFβR1/Smad2/3信号通路是纤维化过程中的关键信号通路，能够上调纤维化相关基因的表达。
三、研究目的
本研究的主要目的是探讨博莱霉素通过TGFβR1/Smad2/3通路诱导BMSCs纤维化转化，从而治疗椎间盘高度丢失的潜力。具体而言，研究旨在：
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评估博莱霉素对BMSCs纤维化转化的影响。
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探讨博莱霉素通过TGFβR1/Smad2/3信号通路上调纤维化相关基因的表达。
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研究博莱霉素在体内外模型中对椎间盘高度丢失的治疗效果。
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探索博莱霉素作为IDD治疗新策略的可行性。
四、研究方法
（一）细胞培养和处理
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BMSCs的分离和培养：从健康志愿者的骨髓中分离BMSCs，使用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基进行培养。
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博莱霉素处理：将BMSCs分为对照组和博莱霉素处理组，分别加入不同浓度的博莱霉素（0、10、20、40 μg/mL），培养24小时。
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信号通路抑制：使用TGFβR1特异性抑制剂SB431542预处理BMSCs，再加入博莱霉素，评估TGFβR1/Smad2/3信号通路的抑制效果。
（二）纤维化相关基因和蛋白的检测
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RNA提取和qRT-PCR：提取BMSCs的总RNA，使用qRT-PCR检测纤维化相关基因（如Col1A1、Col3A1、FN1）的表达水平。
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Western Blot：检测BMSCs中纤维化相关蛋白（如Col1A1、Col3A1、FN1）和TGFβR1/Smad2/3信号通路蛋白的表达水平。
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免疫荧光染色：检测BMSCs中纤维化相关蛋白（如Col1A1、Col3A1、FN1）的表达和定位。
（三）体内外模型的建立
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体外模型：使用博莱霉素处理BMSCs，评估其纤维化转化能力。
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体内模型：使用新西兰大白兔建立椎间盘高度丢失模型，将博莱霉素处理的BMSCs注射到椎间盘内，评估其对椎间盘高度丢失的治疗效果。
（四）组织学和影像学评估
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组织学检查：对椎间盘组织进行苏木精-伊红（H&E）染色和Masson染色，观察组织学变化。
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影像学评估：使用磁共振成像（MRI）评估椎间盘高度和信号强度的变化。
五、研究结果
（一）博莱霉素对BMSCs纤维化转化的影响
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纤维化相关基因表达：qRT-PCR结果显示，博莱霉素处理的BMSCs中，纤维化相关基因（Col1A1、Col3A1、FN1）的表达水平显著上调，且呈剂量依赖性。
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纤维化相关蛋白表达：Western Blot和免疫荧光染色结果显示，博莱霉素处理的BMSCs中，纤维化相关蛋白（Col1A1、Col3A1、FN1）的表达水平显著增加，且主要定位于细胞外基质。
（二）博莱霉素通过TGFβR1/Smad2/3信号通路上调纤维化相关基因的表达
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信号通路激活：Western Blot结果显示，博莱霉素处理的BMSCs中，TGFβR1和Smad2/3的磷酸化水平显著增加，表明TGFβR1/Smad2/3信号通路被激活。
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信号通路抑制：使用TGFβR1特异性抑制剂SB431542预处理BMSCs，博莱霉素上调纤维化相关基因（Col1A1、Col3A1、FN1）的表达被显著抑制，表明博莱霉素通过TGFβR1/Smad2/3信号通路上调纤维化相关基因的表达。
（三）博莱霉素在体内外模型中对椎间盘高度丢失的治疗效果
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体外模型：博莱霉素处理的BMSCs在体外表现出显著的纤维化转化能力，形成大量的纤维化组织。
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体内模型：博莱霉素处理的BMSCs注射到椎间盘内后，MRI结果显示，椎间盘高度显著增加，信号强度恢复正常。组织学检查结果显示，椎间盘组织的纤维化程度显著增加，髓核组织的退化程度减轻。
六、研究结论
本研究表明，博莱霉素通过TGFβR1/Smad2/3信号通路诱导BMSCs纤维化转化，显著促进纤维化相关基因和蛋白的表达，从而有效治疗椎间盘高度丢失。这些发现为IDD的治疗提供了新的策略和理论依据，博莱霉素有望成为IDD治疗的新药物。
七、研究意义
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创新性：本研究首次系统地探讨了博莱霉素在BMSCs纤维化转化中的作用及其通过TGFβR1/Smad2/3信号通路上调纤维化相关基因的表达，为IDD的治疗提供了新的思路。
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临床应用前景：博莱霉素作为一种常用的化疗药物，具有良好的安全性和可获得性，其在IDD治疗中的应用具有重要的临床价值。
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理论贡献：本研究进一步揭示了BMSCs在IDD治疗中的作用机制，丰富了对IDD发病机制和治疗策略的认识。
八、研究展望
未来的研究可以进一步探讨博莱霉素在其他组织修复和再生中的应用潜力，以及其在不同疾病模型中的作用机制。此外，还可以研究博莱霉素与其他药物或细胞治疗的协同作用，开发更有效的治疗策略。通过深入研究博莱霉素，有望为IDD及其他退行性疾病提供新的治疗方法，改善患者的预后和生活质量。
| 名称 | 货号 | 规格 |
| Rabbit anti-Keratin 18 Recombinant Monoclonal Antibody(012-7) | abs130128-25uL | 25uL |
| Rabbit anti-Keratin 18 Recombinant Monoclonal Antibody(012-7) | abs130128-1mL | 1mL |
| SMAD4 (D3M6U) Rabbit mAb | 38454T | 20ul |
| Comet SCGE Assay kit | ADI-900-166 | 50tests |
