流式分析
尽管基因表达及其调控机制复杂多样，但蛋白质作为基因表达的最终产物，才是基因功能的真正执行者。在生物信息学论文以及实验研究论文中，转录水平与蛋白水平的联合检测已成为最常用的研究手段。在进行生物信息学验证时，免疫组化（IHC）通常是首选方法，因为它能够实现定性、定量以及定位的多参数检测，这对于深入理解基因表达的生物学意义具有重要价值。与Western Blot和免疫组化相比，流式细胞术（Flow Cytometry）在操作上更为简便易学，且能够快速提供大量细胞的定量分析数据，特别适用于肿瘤免疫等领域的研究。
流式分析作为一种验证策略
在实验验证中具有重要应用价值。在验证过程中，除了在细胞系水平进行验证外，临床样本尤其是患者的外周血样本也常被用于实验验证。然而，鉴于临床样本的珍贵性，通常需要将获得的样本细胞进行冻存以备后续使用。在流式中文网，niwanmao老师分享了外周血PBMC（外周血单个核细胞）的冻存和复苏经验，这些经验极具参考价值。需要注意的是，外周血PBMC的冻存与普通细胞的冻存存在一定差异，因此在操作过程中需要特别留意。
两次离心法复苏冻存的PBMC细胞
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PBMC的提取与初步处理
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使用Ficoll或Percoll密度梯度离心法从外周血中提取PBMC。
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将分离得到的PBMC使用无菌玻璃吸管转移到装有Tris缓冲盐溶液（pH 7.5）或无血清RPMI 1640培养基的15 mL离心管中。
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在500g的离心力下离心10分钟，去除上清液，以去除残留的血浆和其他杂质。
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PBMC的重悬与预处理
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将离心后的PBMC重悬于4 mL热灭活人血清（heat-inactivated human serum pool，HSP）中。在实际操作中，如果没有AB型血供者的血清，可以使用胎牛血清（FBS）作为替代。
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将重悬后的PBMC在4˚C下静置10分钟，以稳定细胞状态并减少细胞损伤。
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冻存培养基的制备
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制备冻存培养基，将3.2 mL不含L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基与0.8 mL二甲基亚砜（DMSO）混合，确保二甲基亚砜的最终浓度为10%。
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PBMC的冻存操作
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将4˚C预处理后的冻存培养基缓慢滴加到重悬在HSP中的PBMC中，确保细胞均匀分布。
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将含有PBMC的冻存管直接放置在-80˚C冰箱中，随后逐步转移到液氮罐中进行长期保存，以确保细胞的活性和功能。
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注意事项
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温度控制：整个操作过程应在低温下进行，以减少细胞代谢和损伤。
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无菌操作：所有操作步骤均需在无菌条件下进行，以避免污染。
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冻存管的选择：建议使用专门的冻存管，以确保在低温下不会破裂。
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逐步降温：从-80˚C逐步转移到液氮中，有助于减少细胞在快速降温过程中形成的冰晶损伤。
通过上述步骤，可以有效冻存PBMC细胞，确保其在后续实验中的活性和功能。
外周血PBMC的分离和冻存
在临床样本检测或生物信息学实验验证中，我们有时会特别关注各个组织（包括外周血）中不同细胞类群的百分比。那么，全血或通过Ficoll或Percoll提取的外周血单个核细胞（PBMC）中，各类细胞的比例到底是怎样的呢？此外，不同组织（如肺、肝、内脏脂肪组织（VAT）、棕色脂肪组织（BAT）、小肠、胸腺、睾丸、肠系膜淋巴结（MesLN）、皮肤引流淋巴结（sdLN）、脾脏、血液和骨髓（BM））中的主要免疫细胞比例又是如何呢？人和小鼠之间是否存在差异呢？
1. 外周血PBMC的细胞组成
外周血单个核细胞（PBMC）主要包括淋巴细胞、单核细胞和少量的树突状细胞。通过Ficoll或Percoll密度梯度离心法从全血中分离PBMC后，各类细胞的比例大致如下：
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淋巴细胞：约占PBMC的60%-80%，包括T细胞、B细胞和自然杀伤（NK）细胞。
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单核细胞：约占PBMC的10%-20%。
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树突状细胞：占比较小，通常在1%-2%左右。
2. 不同组织中的主要免疫细胞比例
不同组织中的免疫细胞比例存在显著差异，以下是一些常见组织中的主要免疫细胞比例：
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肺：主要包含大量的肺泡巨噬细胞、树突状细胞和T细胞。
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肝：主要包含Kupffer细胞（肝巨噬细胞）、肝窦内皮细胞和少量的T细胞和B细胞。
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内脏脂肪组织（VAT）：主要包含巨噬细胞、T细胞和少量的B细胞。
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棕色脂肪组织（BAT）：主要包含巨噬细胞和T细胞。
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小肠：主要包含大量的树突状细胞、T细胞和B细胞。
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胸腺：主要包含大量的T细胞前体和成熟的T细胞。
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睾丸：主要包含少量的巨噬细胞和T细胞。
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肠系膜淋巴结（MesLN）：主要包含大量的T细胞、B细胞和树突状细胞。
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皮肤引流淋巴结（sdLN）：主要包含大量的T细胞、B细胞和树突状细胞。
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脾脏：主要包含大量的B细胞、T细胞和巨噬细胞。
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血液：主要包含PBMC，如前所述。
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骨髓（BM）：主要包含大量的造血干细胞、巨噬细胞、树突状细胞和少量的T细胞和B细胞。
3. 人和小鼠之间的差异
尽管人类和小鼠在免疫系统的基本结构和功能上有许多相似之处，但在细胞比例和分布上仍存在显著差异。例如：
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T细胞比例：小鼠脾脏中的T细胞比例通常高于人类。
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B细胞比例：人类脾脏中的B细胞比例通常高于小鼠。
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巨噬细胞分布：小鼠的某些组织（如肺和肝）中巨噬细胞的比例可能高于人类。
这些差异在进行跨物种研究时需要特别注意，以确保实验结果的准确性和可比性。
结论
外周血PBMC的分离和冻存是研究免疫细胞的重要步骤。了解不同组织中的免疫细胞比例以及人和小鼠之间的差异，对于设计和解释实验结果具有重要意义。通过精确的细胞分离和冻存技术，可以确保细胞的活性和功能，为后续的实验研究提供可靠的基础。
| 名称 | 货号 | 规格 |
| EdU-555 细胞增殖检测试剂盒（流式） | abs50172-20T | 20T |
| EdU-488/PI 细胞增殖检测试剂盒（流式） | abs50177-20T | 20T |
| EdU-647 细胞增殖检测试剂盒（流式） | abs50173-20T | 20T |
| 7um流式荧光微球，单重APC（固含0.5%，COOH修饰） | abs9724-10ml | 10ml |
