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原核标签蛋白纯化
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1. 质粒构建
1.1 目的基因扩增及表达载体选择
1.1.1 查找目的基因序列1.1.2 选择合适的表达载体1.1.3 确定酶切位点1.1.4 设计引物1.1.5 从细胞中提取总RNA1.1.6 反转录+PCR扩增1.1.7 目的基因的纯化(切胶回收)1.2 酶切和连接
1.2.1 目的基因和载体双酶切1.2.2 目的基因和载体连接1.3 阳性克隆株筛选和鉴定
1.3.1 目的基因转化到感受态中1.3.2 涂板培养1.3.3 菌落PCR鉴定1.3.4 酶切鉴定1.3.5 提取质粒并测序2. 蛋白表达
2.1 提质粒及转化
2.2 大肠杆菌培养及诱导蛋白表达
2.3 跑胶鉴定
3. 蛋白纯化
3.1 标签亲和层析
3.1.1 使用预装柱上机进行纯化3.1.2 使用重力柱方法纯化3.2 离子交换层析
3.3 凝胶过滤层析